Bu test, mikroorganizmaların, besi yerlerine katılan sitratı karbon kaynağı ve amonyum tuzlarını da nitrojen kaynağı olarak kullanabilme yeteneğini saptamada, bakteri cins ve türlerini identifikasyonda kullanılır. Bakteriler tarafından sitratın ayrışması (sitrat metabolizması) enzim sistemi tarafından gerçekleştirilir. Bu enzime citritase (citrate oxalacetate-lyase) veya citrate demolase adı verilir.

Bu enzimin aktivitesi için magnesyum veya manganez tarafından sağlanan divalan katyonlara gereksinim vardır. Sitrat metabolizmasında elde edilen ürünlerin ortamın pH’sı ile sıkı bir ilişkisi vardır. Son ürün ne olursa olsun, sitrat fermentasyonunda esas basamak, piruvat’ın meydana gelişidir. Pirüvatın ayrışma ürünleri besi yerinin pH 'sına bağımlıdır.

Yukarıda da görüldüğü gibi alkali pH da (No.2), daha fazla acetate ve formate meydana gelmesine karşın, asit ortamda (No.3) acetylmethylcarbinol (acetoin) ve lactate’lar esas ününler arasında bulunmaktadır. Sitrat fermentasyonu için kullanılan besi yerlerinde amonyum tuzlarının bulunması nedeniyle de, bakterilerin bu tuzu nitrojen kaynağı olarak kullanabilme yetenekleri de ölçülmektedir. Amonyum tuzu ayrışınca amonyak (NH3) meydana gelerek ortamın pH sı yükselir. Bakteriler tarafından organik asit ve tuzlarının karbon kaynağı olarak kullanılması sonucu karbonatlar ve bikarbonatlar meydana gelir.

Materyal

1) Tüp içinde yatık Simmons citrate agar besi yeri (4-5 ml, pH 6.9 ve yeşil renkte) veya Christensen sitrat sulfid besi yeri (4-5 ml pH 6.7, açık renkte)
2) Test edilecek mikroorganizmaların taze ve saf kültürleri
3) Kontrol pozitif (Klebsiella aerogenes) ve negatif (E. coli) mikroorganizmaları
4) Ekilmemiş besi yerleri

Metot

Muayeneleri yapılacak saf kültürler steril fizyolojik su veya buffer ile biraz sulandırıldıktan sonra besi yerlerine ekimler yapılır ve tüpler 2-7 gün 37 °C inkubasyonda tutulur. Christensen besi yerine iğne ile inokulasyon yapılır ve yatık yüzeye de iğne sürülür.

Değerlendirme

1) Simmons citrate besi yerinde, uygun bir inkubasyon süresi sonunda hiçbir üremenin olmaması ve ortamın orijinal yeşil rengini muhafazası negatif reaksiyon ve ekim hattı boyunca üreme ile birlikte koyu mavi rengin meydana gelmesi de pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir.
2) Christensen sitrat sülfid besi yerinde hiç bir renk değişikliğinin görülmemesi (açık rengin muhafaza edilmesi) negatif reaksiyon ve ekim hattı boyunca üreme ile birlikte pembe-kırmızı rengin oluşumu da pozitif reaksiyonu ifade eder.
3) Değerlendirme, kontrollere bakılarak yapılmalıdır.

Dikkat edilecek noktalar

1) Besi yerleri taze hazırlanmalı, buzdolabında muhafaza edilmeli, orijinal rengini kaybedenler teste konulmamalıdır.
2) Besi yerlerine çok fazla ekim yapılmamalıdır. Yanlış pozitif reaksiyon görülebilir. İnokulum uygun oranda sulandırılmalıdır.
3) Besi yerine konan indikatör boyaların (brom timol mavisi ve fenol kırmızısı) ticari firmalara göre değişmek üzere, aynı miktarların da renk farklılıkları görülebilir. Bu yönden dikkatli bulunmak gerekir.
4) Ekim yapılırken pepton, glikozun veya azotun sitratlı besi yerine taşınması, yanlış pozitif reaksiyona yol açabilir.
5) Kullanılan malzeme kimyasal olarak temiz olmalıdır.
6) Simmons sitrat besi yerinde üreyen bir mikroorganizma Christensen’de de üreyebilir. Ancak, Christensen besi yerinde üreyen Simmons ortamında üremeyebilir. Buna göre de pozitiflik değişebilir.