Bu test, bazı mikroorganizmalarca (özellikle, Pseudomonas spp.) sentezlenen alkalin fosfatase enzim aktivitesini ortaya koymada uygulanır. Fosfatase enzimi, bir fosfomonoesterase olup fosfomonoester substratı üzerine etkilidir. Fosfat esterin hidrolizasyonu sonu inorganik fosfat ve alkol (R-OH) meydana gelir.

Bu reaksiyonda oksijen ile fosfor arasındaki bağ hidrolizasyon sırasında koparak fosfatmonoesterden inorganik fosfat serbest kalır.

Alkalin fosfatase enzimi, alkali pH koşullarında optimal akitviteye sahip olduğundan, bu adı almıştır. Bazıları ısıya dayanıklı olmalarına karşın, bir kısmı ise 70 °C de tahrip olmaktadır.

Materyal
1) Distile suda hazırlanmış % 1 p-nitrophenyl phosphate,
2) Tris buffer (0.02 M, pH 8.0)

3) Katı besiyerinde üremiş 24 saatlik Pseudomonas spp. kültürler.

Metot

Uygun katı bir besiyerinde üretilmiş ve önceden Pseudomonas spp. olarak identifiye edilmiş taze kültürden bir öze dolusu alınarak, tris buffer içinde homojen bir suspansiyon yapılır (MacFarland no 3 (9x108 hücre/ml), bundan 1 ml alınarak iki tüpe 0.5 ml miktarında taksim edilir (tüp-1 ve -2). Tüplerden biri (tüp-1), su banyosuna (70 °C) 20 dakika süre için konulur. Diğer tüp (2) ısıtılmadan oda sıcaklığında bırakılır (kontrol).

Yirmi dakikanın sonunda, her iki tüpe 0.5 ml miktarında % 0.1 p-nitrophenyl phosphate solusyonu (renksiz) konur ve iyice karıştırıldıktan sonra her iki tüp 37 °C de inkubasyona bırakılır. Bu süre bir saat ile 24 saat arasında değişebilir. Kuvvetli pozitif reaksiyonlar, genellikle, bir saat içinde ve koyu bir sarı renkte ortaya çıkar.

Değerlendirme

Tüplerin herhangi birinde sarı bir renk meydana gelmemiş ise, negatif olarak değerlendirilebilir. Ancak, böyle durumlarda, 24 saat kadar beklemek ve sonra karar vermek daha doğrudur. Sarı renk pozitif reaksiyonu ifade eder.
Pseudomonas türleri için
Termostabil: P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. boreopolis
1) Isıtılmış tüp : Pozitif reaksiyon (sarı renk)
2) Isıtılmamış tüp : Pozitif reaksiyon (sarı renk)
Termolabil : Diğer Pseudomonas spp.
1) Isıtılmış tüp: Negatif reaksiyon (renksiz)
2) Isıtılmamış tüp: Pozitif reaksiyon (sarı renk)
Pseudomonas olmayan türler için
1) Isıtılmış tüp: Negatif reaksiyon (renksiz)
2) Isıtılmamış tüp: Negatif reaksiyon (renksiz)

Bu reaksiyonda, renksiz olan p-nitrophenyl phosphate, fosfatase enziminin etkisi ile sarı renkli bir tuz olan p-nitrophenol ve inorganik fosfat halinde ayrışır.

Dikkat edilecek noktalar

1. Teste, pozitif (P. aeruginosa) ve negatif (S. epidermidis) kültürleri de kontrol olarak iştirak ettirilir ve değerlendirmeler bunlara bakılarak gözle yapılır.
2) Teste kullanılacak her iki çözelti de +4 °C kahve renkli şişelerde muhafaza edilir. Pozitif kontrol kültürlerde, zayıf veya şüpheli reaksiyonların elde edildiği durumlarda, reagentler yeniden taze hazırlanmalıdır.
3) Teste tabi tutulacak mikroorganizma, önceden Pseudomonas spp. olarak identifiye edilmiş olmalıdır. Bu test sadece Pseudomonas cinsi içinde bulunan türleri ayırmada kullanılmalıdır. Enterobacteriaceae familyasında bulunan bazı cinsler (Proteus, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Providence, E. coli) fosfatase enzimi sentezlerler. Ancak, bunların çoğu ısıya dirençlidir (termostabil). Bütün Pseudomonas türleri fosfotase enzimi sentezlerler. Bunların da büyük bir kısmı yüksek sıcaklıkta (70 °C 20 dakika) inaktive olurlar (termolabil). Bunlar arasında, P. aeruginosa, P. pseudomallei ve P. boreopolis 'e ait olanlar ısıya dayanıklıdırlar.
4) Testte kullanılacak tüm mikroorganizmalar, bileşiminde çok az oranda fosfat bulunan katı besiyerlerinde üretilmiş olmalıdırlar. Broth kültürleri kullanılmamalıdır.
5) Mikroorganizma suspansiyonları, fosfat buffer içinde yapılmamalıdır. Çünkü, fosfat molekülleri fosfatase aktivitesine mani olur.