Bu test, mikroorganizmaların ısıya dayanıklı olan deoksiribonuklease (DNase) enzimini sentezleyebilme yeteneklerini ölçmede kullanılır. Enzim, hücre çekirdeklerinde bulunan deoksiribonukleik asidi (DNA) depolimerize ederek ayrıştırır. Ayrıca, S. aureus 'ların DNase'lerinin ısı karşısında termonuklease stabilitesini ölçmede de yararlanılır.

DNase aktivitesi, özellikle, koagulaz negatif reaksiyon veren S. aureus 'ların patojenitelerini tayinde yardımcı olur. Bu yönden, S. aureus (+) ve S. epidermidis (-) dir. Ayrıca, birbirlerine yakın pigment vermeyen genuslardan Klebsiella – Enterobacter – Serratia 'ları ayırmada da kullanılır (Serratia spp. (+) Klebsiella ve Enterobacter (-) dir.

Termonuklease testinde, ısı karşısında, S. aureus tarafından sentezlenen DNase varlığı ortaya konur ve S. epidermidis ve diğer mikrokokların oluşturduklarından farkı ortaya konur. Nuklease enzimleri başlıca iki karakter taşır.
1) Endonuklease'ler internal pozisyonda bulunan fosfodiester bağlarını ayrıştırır.
2) Ekzonuklease'ler ise DNA molekülü terminusunda bulunan nukleotid'leri hidrolize eder. DNase, DNA'yı depolimerize ettiği gibi, aynı zamanda polimerizasyonu da katalize eden bir enzimdir.

DNase'ler birçok mikroorganizmanın ekstraksiyonundan elde edilebilir. Ekstrasellüler karakterde olanlar, S. aureus, grup A streptokok, C. diphteriae, S. marcescens, P. aeruginosa, Bacillus spp. ve Vibrio spp. 'den izole edildiği bildirilmiştir. Stafilokokkal DNase'ler hem S. aureus ve hem de S. epidermidis 'den elde edilmiştir. Bunlardan S. aureus 'unki ısıya dayanıklıdır (100 °C 15 dakika). Serratia DNase'leri nonspesifik fosfodiesterase'lerdir.

S. aureus ile Serratia marcescens DNase'leri arasındaki farklar aşağıda gösterilmiştir.

Materyal

Kültür filtratlarında bulunan ekstrasellüler DNaseyi ölçmede aşağıdaki materyal kullanılır.
1) İçinde, son konsantrasyonu 2 mg/ml kadar olan DNA ile toluidin mavisi (% 1) bulunan agar plakları (Toluidin mavisi DNA agar)
2) Teste tabi tutulacak mikroorganizmaların (stafilokok suşları) saf ve taze sıvı kültürleri
3) Kontrol mikroorganizmalar pozitif (S. aureus) ve negatif (S. epidermidis) suşlar.
4) Hidroklorik asit (1 N HCl).

Metot

İncelenecek mikroorganizma kültürlerinden, petri kutusunda ki Toluidin mavisi DNA agar üzerine ortasına (bir noktaya) veya çizgi tarzında ekim yapılır. Petri kutusu 37 °C'de 2-3 gün inkube edilir. Bu sürenin sonunda, ekimin yapıldığı yerlerde üremenin etrafında parlak pembe bir açıklık meydana gelir. Eğer, besiyerinde Toluidin mavisi yoksa o zaman HCl (1 N, solusyonu agar üzerine yayılır.

Değerlendirme

1) Toluidin mavisi DNA agar üzerinde üreme etrafında parlak pembe açık sahanın oluşması DNase pozitif olarak değerlendirilir. Negatif olgularda bir değişiklik görülmez.
Toluidin mavisi içermeyen DNA agar üzerine HCl (1 N) ince bir tabaka halinde yayılır. Pozitif durumlarda üreme etrafında açık bir alan meydana gelir. Buna karşın negatif kültürlerde, üreme etrafında opak bir renk vardır.
2) Termonuklease ölçmek için ise, kültürler su banyosunda ısıtılır (kaynayan suda 15 dakika) ve soğutulur.
Toluidin mavisi DNA agar üzerinde açılan 5 mm çapındaki çukurlara ısıtılmış (kontrol) kültürlerden konulur. Petri kutuları 37°C de 2-4 saat inkube edilirler. Bu sürenin sonunda, etrafında parlak pembe renk oluşan çukurlardaki filtratlarda ısıya dayanıklı (termostabil) DNase (termonuklease) bulunmaktadır (pozitif reaksiyon). Pembe renk göstermeyenler ise negatif olarak kabul edilir (S. marcecens).

Dikkat Edilecek Noktalar

1) Kültürler taze olmalı ve yeterli bir üreme meydana gelmelidir.
2) Deneme çift olarak düzenlenmeli ve hem DNase ve hem de termonuklease akitvite ölçülmelidir.
3) DNase'lerin çoğu aktiviteleri için besiyerlerinde divalan katyonlara gereksinimleri vardır.
4) Negatif durumlarda, gerektiğinde inkubasyon süreleri uzatılabilir.