Bu test, bir homopolisakkarid olan nişastanın, bazı mikroorganizmalarca sentezlenen ekstrasellüler amilase enzimi tarafından hidrolizasyonunu ortaya koymak amacı ile yapılır. Ayrıca bu test bakteri cins ve türlerinin belirlenmesinde de yardımcı olur. Nişastanın glikoz'a kadar olan ayrışma aşamaları yanda gösterilmiştir.

Materyal

1) Petri kutularında hazırlanmış nişastalı agar besi yerleri
2) Denenecek mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol mikroorganizmalar [(E. coli (-) ve B. subtilis (+)]
4) Lugol solusyonu veya % 95 etanol
5) Test, agar üzerinde olduğu gibi, sıvı kültürler (nişastalı buyyon) içinde de yapılabilir.

Metot

Nişasta hidrolizasyon aktivitesi ölçülecek mikroorganizmadan nişastalı agar üzerine çizgi tarzında ekimler yapılır ve 37°C de 2-5 gün inkube edilirler.

Diğer bir besi yeri de iki kısma ayrılarak her bir yarımına kontrol mikroorganizmalar ekilir.

Değerlendirme

1) İnkubasyon süresinin sonunda agarların üzeri lugol solusyonu ile kaplanır. Pozitif reaksiyonlarda, koloni etrafında renksiz bir halka oluşur (alfa-amilase enziminin nişastayı hidrolizasyonu sonu). Negatif durumlarda besi yeri mavi renkte görülür. Koloni etrafındaki oluşan pembe-esmer bölge şüpheli reaksiyonu ifade eder. Reaksiyon 5 dakika içinde okunmalıdır.
2) Petri kutuları üzerine lugol solusyonu yerine 8-10 ml % 95 etanol'de konulabilir. Nişastanın hidrolizasyonu halinde koloni etrafında açık alan meydana gelir (pozitif amilase). Negatif durumlarda bu alan süt beyazı görünümündedir. Reaksiyon 30 dakika içinde okunur. Her iki yöntemde de lugol ve etanol döküldükten sonra değerlendirme yapılır.

Dikkat edilecek noktalar:

1) Nişastalı katı veya sıvı besi yerleri çok fazla ısıtılmamalıdır.
2) Besi yerleri nötr (pH 7.2) olmalıdır.
3) Nişastalı besi yerleri taze oldukları zaman daha belirgin ve çabuk sonuç verirler. Eski besi yerleri ise opaklaşır ve yanlış değerlendirmelere yol açar.
4) Besi yerlerinde, alfa -amilase aktivitesi için klorid iyonları bulunması gereklidir. Bu nedenle klorid iyonlarının en az 0.01 M konsentrasyonunda olması gereklidir.
5) Besi yerlerinin buzdolabında bulunması ve muhafazası opaklaşmaya yol açar.
6) Testte kullanılan lugol solusyonu 1/5 sulandırılarak kullanılır. Saf lugol yanlış negatif sonuçlara yol açar.
7) Lugol solusyonu besi yeri üzerinde 5 dakika (etanol 30 dakika) tutulduktan sonra dökülür ve değerlendirme yapılır.