Karbonhidrat Fermentasyon Testi

Bu test, mikroorganizmaların çeşitli spesifik karbonhidratları ayrıştırma yeteneklerini (sakkarolitik aktivite) belirlemek amacı ile yapılmaktadır. Mikroorganizmalar karbonhidratları, kendileri tarafından sentezlenen hidrolase (karbohidrase) enzimleri yardımı ile ayrıştırırlar. Ancak bu yetenek mikroplar arasında oldukça fazla değişiklik gösterdiği gibi, bir türe ait mikroorganizmalar arasında da ayrı fermentasyon özelliği gösteren variant suşlar da meydana çıkmaktadır. Bazı mikroorganizmaların fermentasyon özelliği yok denecek kadar az olmasına karşın Enterobacteriaceae familyasına ait olanlarda bu aktivite oldukça yüksektir.

Karbonhidratlar (monosakkarid, polisakkarid ve alkoller), bakteriler tarafından değişik tarzda (aerobik ve anaerobik) ayrıştırılarak çeşitli ürünler, organik asitler (asetik asit, butirik asit, formik asit, laktik asit, propionik asit, suksinik asit, vs.), nötral ürünler (Asetilmetilkarbinol, 2,3-butilenglikol, aseton, etil alkol, isopropil alkol, butil alkol, vs.) ve gazlar (hidrojen, oksijen, metan, karbondioksit) meydana gelirler.

Bu maddeler çeşitli testler yardımı ile ortaya konabilir ve mikroorganizmaların identifikasyonunda önemli göreve sahip olurlar. Enerji ve karbon kaynağı olarak, karbonhidratların önemi fazladır. Metabolize olabilenlerin üreme üzerine olumlu etkileri vardır. Ancak, ayrışma sonu oluşan organik asitler, besi yerinin pH sını düşürerek belli bir süre sonra üremeyi sınırlar ve durdururlar. Bu yönden de zararlı etkisi olur. Karbonhidratların aerobik ayrışması sonu çok fazla enerji ortaya çıkmasına karşın anaerobik ayrışmada (fermentasyon) enerji daha az çıkmakta ve organik asit oluşumu daha fazla görülmektedir. Laboratuvarlarda kullanılan besi yerleri ve diğer koşulların etkisi altında, mikroorganizma türlerine göre değişmek üzere, karbonhidratların ayrışması, genellikle, 1-10 gün arasında değişmektedir. Bazen daha uzun bir süreye gereksinim duyulabilir. Ayrışmayı ortaya koyabilmek için besi yerlerine üreme üzerine olumsuz etkisi olmayacak yoğunlukta bazı indikatörler (Andrade, bromkrezol moru, brom timol mavisi, fenol kırmızısı, vs.) katılır. Bunların özelliklerine göre renklerinde meydana gelen değişmeler ayrışmayı ve derecesini belirtir. Bu indikatörler besi yerlerine, yukarıdaki sıraya göre, % .005, % 0.0025, % 0.001 son konsentrasyonda olacak tarzda ilave edilirler. Andrade hariç olmak üzere diğerleri asit ortamlarda sarı renk meydana getirirler. Besi yerlerinde gaz oluşumunu saptamada, tersine yerleştirilmiş küçük Durham tüplerinden yararlanılır. Gaz, bu tüpün üst tarafında birikir. Bu amaçla özel Smith tüpleri de kullanılabilir. Nötral ürünlerden asetoin'i (asetil metilkarbinol) saptamada Voges Proskauer (VP) reaksiyonu laboratuvarlarca benimsenmektedir.

Materyal

1) İçinde % 1 oranında çeşitli karbonhidratları içeren indikatörlü ve Durham tüplü steril peptonlu su veya uygun bir sıvı besi yeri (4-5 ml). Durham tüpleri genelilkle glikoz'lu besi yerine konmaktadır (Salicin % 0.5, olarak hazırlanır).
2) Muayenesi yapılacak mikroorganizmanın taze saf kültürü.

Metotİyi üremiş saf kültürlerden 0.1 ml kadar alınarak ayrı ayrı karbonhidrat içeren tüplere ekilir ve iyice karıştırıldıktan sonra tüpler 37 °C de inkubasyona (1-10 gün) bırakılırlar. Tüpler her gün sabah-akşam, gaz ve asit oluşumu önünden muayene edilerek, kontrollerle birlikte, gözle değerlendirilirler. Gerektiği hallerde okuma süresi uzatılabilir.

Değerlendirme

Kullanılan indikatörün özelliğine göre aşağıdaki tarzda karar verilir:

İndikatör

Asit

Nötr

Alkali

Andrade

kırmızı

sarı

renksiz

Bromtimol mavisi

sarı

hafif mavi

mavi – koyu mavi

Bromkresol moru

sarımsı

morumsu

mor

Fenol Kırmızısı

sarı

renksiz

pembe

Yukarıda bildirilen renk değişmeleri pH durumlarına göre oldukça fazla farklılıklar göstermektedir. Bunları dikkate almak gereklidir.

Dikkat edilecek noktalar

1) Bazı peptonlar bileşimlerinde karbonhidrat içerdiğinden, bu test için uygun değildirler. Bu yönden dikkatli bulunmak gerekir.
2) Test için kullanılacak ortamlarda nitrat da bulunamamalıdır. Bu maddenin varlığı gaz podüksiyonunu önleyebilir.
3) Karbonhidratlar filtrasyonla sterilize edildikten sonra tavsiye edilen miktar ve konsentrasyonlarda besi yerlerine katılırlar.
4) Durham tüpleri gerek görülürse, glikoz'lu tüp yanı sıra diğer karbonhidratlar için de kullanılabilir.
5) Sonuçlar, uygun bir süre sonra, kontrol tüplerle, karşılaştırılarak değerlendirilir. Mikroorganizma ekilmemiş, indikatörlü ve karbonhidratlı tüpler de denemeye iştirak ettirilmelidir.
6) Sonuçlar, pozitif (+) veya negatif (-) olarak belirtilmelidir.
7) Mikroorganizmaları iyi üretmek için besi yerlerine katılan serumlarda bulunan enzimler, maltoz'u glikoz'a ayrıştırabilir. Bu nedenle, serumların inaktive edilmesinde yarar vardır.
8) Anaerobik mikroorganizmalar için anaerobik koşullar sağlanmalı ve yeterli süre ayrılmalıdır.
9) Katı besi yerleri de aynı amaçlar için kullanılabilirse de sıvı ortamlar laboratuvarlarca daha fazla tercih edilmektedir. Son yıllarda çeşitli karbonhidratlara emdirilmiş steril kağıt disklerden de yararlanılmaktadır.
10) Değerlendirilmelerde kullanılan indikatörün pH limitlerine göre aldığı renk değişimlerini çok iyi bilmek gerekir.