Bu test, o-nitrophenyl - beta-D-galactoside'in (ONPG) ayrışmasını katalize eden beta-galaktosidase enziminin varlığının belirlenmesi amacıyla yapılmaktadır. Beta galaktosidase ortamda bulanan basit galoktozid'leri (laktoz dahil) ayrıştıran ve indüklenebilen intrasellüler bir enzimdir.

Bakterilerin, laktozu fermantasyon kabiliyeti, ortamda bulunan ONPG 'nin ayrışması için gerekli olan beta-galaktosidase enziminin varlığına bağlıdır. Eğer besiyerinde galaktosidase pozitif bir bakteri varsa, renksiz olan ONPG hidrolize edilerek, sarı kromojenik bir madde olan O-nitrofenol (ONP) serbest kalır. Pozitif reaksiyon da bu maddenin tespiti üzerine dayanır. Serbest kalan o-nitrofenol, alkali bir solusyonda bulunursa, tautometrik değişmelere maruz kalarak sarı renk meydana getirir.

Asit ortamlarda ise sarı renkli bir görünümdedir. Bu nedenle de ß-galaktosidase aktivitesini ölçmede, besi yerinin iyi buffer'lı olması gerekir.

Bu reaksiyon, özellikle, laktozu geç parçalayan veya şüpheli reaksiyon veren mikroorganizmalara kesinlik kazandırmada işe yarar. Böyle bakterilerin çoğu ß-galaktosidase pozitif reaksiyon vermektedirler. Pozitif reaksiyon laktozun fermente olduğunu gösterir.

Materyal

1) İçinde ONPG bulunan 5 ml miktarında sıvı besiyeri.
2) Muayene edilecek mikroorganizmaların saf ve taze sıvı kültürleri.
3) Kontrol pozitif (E. coli) ve negatif (P. morganii) suşların kültürleri

Metot

ONPG brothda mikroorganizmalar bolca ekildikten sonra 37 °C de 18-24 saat inkubasyona bırakılırlar. Sürenin sonunda kültürler santrifuje edilerek üst taraf atılır. Bakteri tortusuna 0.25 ml fizyolojik su ilave edilerek homojen bir suspansiyon yapılır. Buna bir damla toluene konularak iyice çalkalanır. Tüp 37 °C de 5-10 dakika su banyosuna bırakılır. Sonra, buna 0.25 ml ONPG solusyonu katılır ve tekrar su banyosuna 20 dakika ile 24 saat süre ile konulur. Tüplerdeki renk değişimine dikkat edilir. Tüplerde 20 dakika içinde bir değişiklik yoksa inkubasyona devam edilir.

Değerlendirme

Tüplerde sarı rengin meydana gelmesi ONPG nin hidrolize edildiğini (pozitif reaksiyon) ve renksiz olması da negatif reaksiyonu gösterir.

Dikkat Edilecek Noktalar

1) Kimyasal maddeler (ONPG, toluene, NaCl, vs.) saf ve en iyi kalitede olmalıdır.
2) ONPG solusyonu renksiz olmalıdır. Çalıştığı (etkinliği) pozitif ve negatif kontroller de denenmelidir.
3) İndikatörler buzdolabı sıcaklığında tutulmalıdır. Kullanılacağı zaman su banyosuna (37°C) konarak hafifçe sıcaklığı yükseltilmelidir (özellikle, ONPG solusyonu için).
4) Besiyerinin pH sının iyi ayarlanması gerekir, genellikle 7.5 civarında olmalıdır. Asit ortamda reaksiyon meydana gelmez.
5) Sarı pigment veren (kromojenik) bakterilerde, test, uygulanmamalıdır.
6) Ortamda glikoz bulunmamalıdır (ß galaktozidase aktivitesine mani olur).