Mikroorganizmaların Klasifikasyonu

Mikroorganizmaların keşfinden önce, doğadaki bütün canlı yaratıkların hayvan ya da bitki orijinli olduğu ve başka ara türlerin olmayacağı düşünülürdü. Mikroskobun keşfi ve bunun yardımı ile mikroorganizmaların bulunması, durumu tamamıyla değiştirmiş ve gözle görülmeyen başka bir Mikroskobik canlılar aleminin varlığını ortaya koymuştur. Bu mikroskobik canlıların insan ve hayvanlarda hastalık oluşturdukları saptandıktan sonra, önemleri daha da artmış ve üzerlerinde yoğun çalışmalar yapılmış ve hala da yapılmaya devam etmektedir. Mikroorganizmaları belli, geçerli ve devamlı bir klasifikasyona tabi tutma fikri eskiden başlamış olmasına karşın, yeni mikropların bulunması ve bunların değişik karakterlere sahip olmaları nedeniyle yapılan sistematikler devamlı değişmekte ve yerlerine yeni bulgulara uygun olanları hazırlanmakta ve konulmaktadır. Ayrıca mikroorganizmaların gözle görülmemeleri ve küçük olmaları bunların birçok özelliğinin saptanamamasına da yol açmaktadır. Bu durum da sistematiğin geçerliğini ve devamlılığını olumsuz yönde etkilemektedir. Mikrobiyolojik teknikler ilerledikçe, mikroorganizmaların karakterlerinin büyük bir bölümü açığa kavuşmakta ve sistematikteki yerleri de daha sağlam, belirgin ve değişik olmaktadır.

Mikropları ilk bulan, şekillerini çizen ve hareketlerini izleyen A. van Leeuwenhoek'dan sonra, İşveçli bir botanist olan Carl von Linne (Carolus Linneaus) bakterileri kendi yaptığı bir sınıflamaya dahil etmiş ve ilk defa binomial sistem içinde klasifikasyona çalışmıştır. Linne "Species Plantarum ve Systema Naturae" adlı eserinde binomial sisteme göre isimlendirmeye özen göstermiştir. Bu sistemde, bir mikroorganizma iki bilimsel adla belirlenmektedir. Bunlardan biri cins (genus) ve diğeri de tür (species) ismidir. Danimarkalı bir doğa bilimcisi olan Otto Frederich Müller, 1773' de, mikroorganizmaları sınıflandırmaya çalışmış ve kendi sistematiğinde bakteri içeren iki cinse yer vermiştir. 1-Monas: oval ve yuvarlak bakteri türlerini ve 2- Vibrio: uzun formlu (çomak biçiminde) olanları içine almaktadır. Bir Alman zoolojist olan C.G.Ehrenberg 1828 ile 1838 yılları arasında, sınıflandırmayı biraz genişletmiş içine bakterilerin yanı sıra protozoonları da katmış ve bunların bazı özelliklerini de tanımlamıştır. Ehrenberg, mikroorganizmaları 4 cinse ayırmıştır (Bacterium, Spirillum, Spirochaeta, Spirodiscus). Alman bir biyolojist olan E.H.Haekel, tek hücreli canlıları, gerçek hayvan ve bitkilerinden ayırmak için, bunları, üçüncü ve ayrı bir grup içinde (Protista) toplamıştır (1886). Mikroorganizmaların morfolojik karakterlerini esas alan bir klasifikasyon F.Cohn tarafından 1872'de yapılmıştır. Bu sınıflamada birçok sporlu mikroplara da yer verilmiştir. Migula, 1897'de, mikropları sadece morfolojilerine göre değil, aynı zamanda renk (koloni) ve bazı fizyolojik karakterlerini dikkate alan (nitrogen fiksasyonu gibi) bir sistem geliştirmiş ve bunu "System of the bacteria" adı altında yayımlamıştır. Aynı yıllarda, Lehmann ve Neumann, "Atlas for the diagnostic bacteriology" adı altında bir yayın da yapmışlardır (1886). D.F.Chester, 1899 ve 1901 yılları arasında, "Manual of determinative bacteriology"yi yayımlamışlar ve bu eser, "Society of American Bacteriologists"in kurulmasına önderlik etmiştir. Orla-Jensen 1909'da, bakterilerin fizyolojik özelliklerini içine alan bir sistematik hazırlamış ve bu klasifikasyon sonrakilere örnek teşkil etmiştir. Bakterileri modern anlamda ilk sistematize etmek, Buchanan ile başlamıştır (1917). Buchanan, Schizomycetes sınıfını 6 takıma ayırmayı teklif etmiştir. Başta Buchanan olmak üzere kendinden önce yüzden fazla mikrobiyologun teşviki ve yardımı ile, ilk defa, 1923'de Society of American Bacteriologists tarafından "Manual of Determinative Bacteriology" yayımlanmıştır. Bu kitabı hazırlayan komitenin başına da D.H. Bergey getirilmiştir. Bu manual zamanla geliştirilerek 1974'de 8. baskısını yapmıştır. 1984-1986 yıllarında "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" adı altında ve 4 ciltlik bir yayın çıkarılmıştır. Determinatif bakteriyolojinin 1994 de 9. baskısı yapılmıştır.

Yukarıda gösterildiği gibi bakteriler, bir çok karakterler esas alınarak sınıflandırmalara tabi tutulmuşlardır. Bunların avantaj ve dezavantajları olduğu gibi zamana göre de değişiklikler göstermektedirler. Bu tarihsel gelişim içinde bakterilerinin taksonomisi konusunda yapılan girişimler, ele alınan başlıca kriterler ve bunlara göre yapılan sınıflandırmaların en önemlileri aşağıda bildirilmiştir.

1) Doğal (filojenik) klasifikasyon: Bu sistematiğin esasını, mikroorganizmalardan birbirlerine çok benzeyenleri, muhtemelen aynı orijinden gelenleri, bir araya toplamak ayrı karakter taşıyanları çıkarmak oluşturmaktadır. Burada benzerlik kavramı içinde, morfolojik, kültürel, fizyolojik, biyokimyasal, kimyasal, serolojik, patolojik, vs. özellikler de bulunmaktadır.

2) Numerikal klasifikason: Bu tarz sınıflama, Fransız zoolojisti M. Adanson tarafından 1757'de yapılmış ve kendi adı ile anılmıştır (Adansonian klasifikasyonu). Bu sistem, bakterilere Sneath tarafından uygulanmıştır. Bu sistemde mikroorganizmaların benzeyen ve benzemeyen yönleri değerlendirmeye tabi tutulur. Böylece, taksonomik uzaklık, ortak olan karakterlerin toplam karakterlere oranından hesaplanır. Bu yöntem için bir çok fenotipik özelliklere (görülebilen veya saptanabilen) gereksinim vardır. Benzer karakterlere (+) ve benzemeyenlere de (-) puan verilir. Değerlendirmeler aşağıdaki tarz da yapılır. Örn, iki mikroorganizmanın arasındaki benzerlik ve uygunluk kat sayısının tayininde:

Benzerlik indeksi (%S) = (Nsp X 100) / (Nsp + Nd)

Benzerlik koefisienti (katsayısı ; %S) = (Nsp X Nsn X 100) / (Nsp + Nsn + nd)

Nsp: Her iki suşta da benzer (pozitif) olan karakterler

Nsn: Her iki suşta benzer olmayan (negatif) karakterler

Nd: Birinde pozitif ve diğerinde negatif olan karakterler

Birbirlerine benzer durumlarda S=100 ve hiç benzemeyenler de S=0 olur. Böylece mikroorganizmalar 100 ile 0 arasında benzerlik indeksine göre sıralanırlar.

3) Genetik klasifikasyon: Son yıllarda, mikroorganizmalar arasında benzerlik veya ayrılıkları saptamada, bunların oldukça yüzeysel ve değişken olan benzerliklerinden ziyade, genetik materyalleri, özellikle DNA'ları, arasındaki homojenlik durumlarına dayanan daha esaslı ve tutarlı bir klasifikasyona gidilmektedir. Bu tarz klasifikasyon bakterilerin nükleik asit analizlerini gerektirmekte ve bu işlem için de iki önemli yöntem kullanılmaktadır. Bunlardan biri, DNA'lardaki baz sıralarının yüzde olarak kompozisyonu ve diğeri de mikroorganizmalar arasında DNA x DNA veya DNA x RNA hibridizasyon oranlarıdır.

Bakteri DNA'sı (deoksiribonukleik asit), iki sarmal biçimde polinukleotid iplikçiklerinden oluşmakta ve bunların yapısında da pürin (adenin, guanin) ve primidin (timin, sitozin) bazları bulunmaktadır. Bir iplikçik üzerindeki pürin bazları, diğer iplikçikteki pirimidin bazları ile karşılıklı olarak hidrojen bağları ile birleşmişlerdir. Yani, bir iplikçikteki adenin, karşı iplikçikteki timin'le aynı tarzda guanin de sitozin ile bağlanmıştır. Adenin ile timin arasında iki hidrojen bağı olamasına karşın guanin ile sitozin arasında 3 hidrojen bağı vardır. Böylece DNA' da pürin bazları ile pirimidin baz sayıları birbirlerine eşit olmuş olur (A=T ve G=C). Buna göre, türlere göre değişmek üzere, A+T ve G+C molar oranları yüzdesi sabit kalmış olur. Genetik analizlerde guanin ile sitozin arasında 3 bağın olması bu baz çiftini daha sağlam yaptığından genetik analizlerde G+C'nin yüzde (%) oranı esas alınır. Bunun için de aşağıda belirtilen formül yardımıyla DNA'lardaki G+C miktarının yüzde oranı saptanabilir ve aralarındaki ilişki belirlenebilir.

% G+C= [(G+C) X 100] / (A+T+G+C)

Bu oran bakteri türleri arasında değişiklik göstermesine karşılık her bakteri türü için sabittir. Aşağıdaki tablo Pseudomonas türleri arasındaki %G+C oranını göstermektedir.

P. aeruginosa türleri

Muayene edilen
suş sayısı

%G+C ortalama
değeri

P. aeruginosa

11

67,2±1,1

P. acidovorans

15

66,8±1,0

P. testesteroni

9

61,8±1,0

P. cepacia

12

67,6±0,8

P. pseudomallei

6

69,5±0,7

P. putida

6

62,5±0,9

Gram negatif çomak biçimindeki enterik mikroorganizmalarda %G+C oranı, genellikle, 39-59 arasında bulunmaktadır. Pseudomonas 'ların bazı türlerinde bu oran 59-70 ve bazı spor oluşturan cinslerde (Bacillus ve Clostridium) 23-62 arasıdır. Görüldüğü üzere, bu son grupta %G+C oranı geniş bir varyasyon (heterojenite) göstermektedir. Hesaplamalar sonunda, % G+C oranı %10'dan daha fazla olan türlerde, çok az baz sırasında ortaklığın bulunması nedeniyle birbirleri ile ilişkili kabul edilememektedirler. Önceleri, fenotipik karakterlerine göre benzer oldukları kabul edilen Myxobacteria (%G+C oranı 67-70) ile Cytophagae (%G+C oranı 33-47) genetik analizler sonucu birbirlerinden ayrı çıkmışlardır. Benzer duruma S. aureus (G+C oranı 32-34) ile Micrococcus luteus (G+C oranı 70-80) arasında da rastlanmaktadır. Aşağıdaki çizelgede bazı bakterilerin E. coli 'ye göre ilişkileri gösterilmektedir.

DNA kaynağı
mikroorganizma

E. coli 'ye
göre ilişki

E. coli

100

S. dysenteria

89

S. typhimurium

45

E. aerogenes

35

S. marcescens

20

P. vulgaris

10

P. aeruginosa

1

B. subtilis

1

B. neotama

0

Nukleik asit hibridizasyonu ile de bakteriler arasındaki genetik ilişki (yakınlık veya uzaklık) saptanabilir. Bir bakterinin DNA suspansiyonu yavaş yavaş ısıtılırsa, bazlar arasındaki hidrojen bağları çözülür ve iki polinukleotid iplikçiği birbirlerinden ayrılır (DNA denaturasyonu). Eğer solusyon yavaş yavaş soğutulursa bağlar karşılıklı olarak tekrar kurulur ve DNA orijinal çift iplikçikli formuna kavuşur (renaturasyon). Bu durumdan yararlanılarak, DNA hibridizasyon testi yapılmaktadır. Şöyle ki, iki bakteriye ait DNA solusyonu %3 agar içeren bir tüp içinde karıştırılır ve 105 °C 'ye kadar yavaş yavaş ısıtılır ve bu derecede 10 dakika tutulur. Bu süre sonunda, DNA'lar arasındaki karşılıklı hidrojen bağları çözülür ve ortamda 4 tane serbest (tek iplikçik halinde) polinukleotid iplikciği bulunmuş olur. Sonra, karışım yavaş yavaş soğutulur ve böylece karşılıklı iplikçiklerin tekrar birleşmesi veya rekombinasyonu sağlanır. Karışım fosfodiesterase enzimi ile muamele edilerek, birleşmeyen veya kalan tek iplikçiklerin erimesi sağlanır (bu enzimin birleşmiş çift iplikçikli DNA'ya etkisi olmamaktadır). Bu tekrar birleşme sırasında eğer iki türe ait denature polinukleotid iplikçikleri arasında baz sıralarında benzerlik varsa veya aynı iseler karşılıklı bağlanmalar (hidrojen bağlanmaları) meydana gelecektir (heterolog DNA dupleksi). Eğer bakterinin birine ait DNA iplikçiklerinden biri izotopla birleştirilmiş (izoptik, 14C timin) ve diğer bakterinin ki normal ise, bu iki bakteri de birbirlerine genetik olarak çok yakın iseler izoptik DNA ile diğer bakterinin DNA'sı birleşebilir ve bu birleşmenin oranı saptanabilir. Bu tarz uygulama (DNA hibridizasyon, heterolog DNA dupleksi), bir DNA+DNA hibridizasyonudur. Bir birlerine baz sıraları ne kadar çok yakın ise, DNA+DNA hibridizasyon oranı da o derecede yüksektir. Böyle bir durum, bu iki bakterinin aynı tür veya aynı cinsin iki türü olduğunu kanıtlar. Örn, P. fluorescens %100 oranında aynı türle birleşir. Buna karşın aynı cinsin başka bir türü ile daha az oranda (%83 gibi) bir birleşme yapar.

Bir organizmaya ait olan denatüre DNA iplikçiği, diğer bir organizmanın mRNA (tRNA veya rRNA) sı ile birleştirilebilir. Burada da durum yukarıdakinin aynısıdır. Diğer bir ifade ile, RNA'nın DNA'ya komplementer durumu esas rolü oynamaktadır (DNA+RNA hibridizasyonu).

4) Antijenik klasifikasyon: Yukarıda açıklanan sınıflandırmaların dışında, bazı bakteri familya veya cinslerini kapsayan ve antijenik yapılarını esas alan bir klasifikasyon da yapılmıştır (antijenik klasifikasyon). Ancak, bu genetik sınıflama kadar genellenememektedir. Çünkü, cins veya türler içinde çok fazla antijenik değişmeler ortaya çıkmaktadır. Örn, S. pneumoniae, kapsül yapısına göre 75'den fazla antijenik tipe; P. multocidae, kapsüler polisakkaridlerine göre 4 antijenik tipe (A, B, C, D) ve L. monocytogenes ise 8'den fazla serotipe ayrılmaktadır. Bu nedenlerle, antijenik analizlere dayanan sınıflama ancak tür içinde yararlı olmaktadır. Antijenik klasifikasyonda başlıca 2 özellik dikkate alınmaktadır. 1-Yüzey antijenik moleküller (pilus, flagella, kapsül, hücre duvarı, mukoid tabaka) ve 2-Pürifiye proteinlere karşı hazırlanmış antiserumlarla, çeşitli bakterilerden elde edilen homolog proteinlerin arasındaki yapısal benzerlikler incelenmektedir.

5) Fajla tiplendirme: Türler içi veya türler arası ilişkiyi saptamada fajla tiplendirme de kullanılmaktadır. Aynı türe ait suşlar, kendilerine özgü fajlara göre gruplara ayrılabilmektedirler. Örn, S. aureus, bu esasa göre Grup -1, -2, -3 ve 4'e ayrılmaktadır. Ancak, insan, sığır veya diğer hayvanlardan izole edilen etkenlerin aynı faj setleri ile reaksiyon vermedikleri türlere özgü bazı spesifitelerin bulunması nedeniyle, fajlara dayanan bir klasifikasyon ancak çok sınırlı kalmaktadır. Fajlar aynı zamanda yeni izole edilen etkenlerin teşhisinde de rol oynamaktadırlar.

Ancak, bazı fajların tür spesifiteleri'de çok sınırlıdır. Her yönü ile kesin teşhisi yapılan bir mikroorganizma, (Aeromonas hydrophila) kendi türüne özgü fajlarla reaksiyon vermeyebilir. Bu nedenle etkenin teşhisinde rolleri az olmakta veya tam yararlı olamamaktadırlar (Örn., Aeh1 ve -2 fajları gibi)

6) Kemotaksonomi: Daha az oranda spesifitesi olan ve bakterilerin kimyasal yapılarını esas alan bu sınıflama da, bakterilerde çok değişken olan yapısal özellikler nedeniyle genetik sınıflama kadar tutarlı bulunmamaktadır. Bakterilerin kimyasal yapıları her ne kadar genetik bir özellik gösterirse de, bunların yetiştiği veya ürediği besi yerinin kimyasal yapısı, osmotik basıncı, pH, vs. gibi çevresel koşullar da fazlaca etkilenmekte ve değişebilmektedir. İncelenebilen kimyasal karakterler arasında, başlıca, hücre duvar kompozisyonu, lipid kompozisyonu, çeşitli proteinlerin amino asit sıraları ve türleri, enzim karakterleri, pilus, flagella proteinlerinin kompozisyonları, vs. vardır.