Sıvı Ortamda Üreme

Mikroorganizmalar optimal koşulları içeren sıvı ortamlarda, katı besi yerlerinden daha çabuk ürerler. Üremenin hızı, mikrop türüne özgü genetik bir karakter olmakla beraber, besi yerinin bileşimi ve çevresel koşullarla da yakından ilişkilidir. Mikroorganizmalar, ikiye bölünmek suretiyle geometrik bir üreme tarzı gösterirler.

1

—›

2

—›

4

—›

8

—›

16

—›

32

—›

...

20

21

—›

22

—›

23

—›

24

—›

25

—›

...

Bu geometrik üremenin matematiksel ifadesi de (1x2n)'dir. Bakteri populasyonunda meydana gelen her bölünmeye generasyon ve iki generasyon arasında geçen zamana da generasyon süresi adı verilir. Her generasyon sonunda populasyondaki fert sayısı iki misli artar. Generasyon süresi bakterilerde çok değişiklik gösterir. E. coli 'de 18-20 ve S. aureus 'da 27-30 dakika olan genarasyon süresi, Mycobacterium tuberculosis 'de 792-932 dakikadır.

Mikroorganizmalarda generasyon sayısını ve süresini hesaplamak mümkündür. Bunun için başlangıçta sıfır zamanda ekilen mikrop sayısını (a), aradan geçen zamanı (t) ve bu süre sonundaki mikrop sayısını (b) bilmek gereklidir. Optimal koşulları içeren bir besi yerine bir adet mikrop ekilirse belli bir süre (t) sonra mikrop sayısı (b) aşağıdaki tarzda bulunur;

b = a x 22 formülünde 2n, n kadar sayıdaki generasyon sonundaki bakteri sayısını ifade eder. Eğer sıfır zamanda, (a) sayıda mikrop ekilmişse, total mikrop sayısı (b),

b = a x 2n (veya Nn = 2n No) olur.Bu eşitlikten yararlanarak generasyon süresi (g) ve sayısı (n) hesaplanabilir. Yukarıdaki denklemin logaritması alınır.

log b = (log a + n. log 2) ; Buradan

n= (log b - log.a) / log 2 olur. Diğer taraftan

n = t / g olduğundan

(t / g) = (log b –log.a) / log 2 olur.

Bu eşitlikten yararlanılarak,

g = (t x log 2) / (log b –log a) elde edilir.

Örneğin, a = 103, b = 109 ve t = 10 saat ise,

n = 109 – 103 / 0,3 = 6 / 0,3 = 20 (generasyon sayısı)

g = 10 x 0,3 /109 – 103 = 3 / 6 = 1/2 saat (generasyon süresi)

elde edilen sonuçlara göre, her yarım saatte bir generasyon olmak üzere, 20 generasyon aradan geçmiş bulunmaktadır.

Generasyon süresi (g), spektrofotometrik yöntemlerle de saptanabilir. Buna göre yapılan hesaplamada, optik dansite (OD) esas alınır ve aynı formül uygulanır.

g = t x log.2 / ODb -ODa

Bu formülde, t süresi sonunda optikal densite (ODb) ile başlangıçtaki optikal densite (ODa) kullanılmıştır.

Uygun bir besiyerine ekilen bir mikroorganizmanın belli bir süre içindeki üreme durumu başlıca 4 evre gösterir. Yandaki şekilde a) Latent dönem, b) Üreme dönemi (logaritmik dönem), c) durma dönemi, d) ölme dönemi görülmektedir.

Bakterilerin Uygun Sıvı Ortamda Üremesi

A) Latent dönem: Bu fazda yeni veya değişik ortama ekilen mikroplarda üreme olmadığından sayıca da bir artma olmaz. Buna karşın, bakteriler yeni enzimler, metabolik intermedierler ve gerekli maddeleri sentezlediğinden, metabolizma artmıştır. Bu dönem, aynı zamanda, mikroorganizmaların, ortama adaptasyonlarını da sağlar. Adapte olamayanların ölmeleri nedeniyle mikrop sayısında azalmalar da görülebilir. Ortama uyabilen ve yeni maddeler hazırlayan mikroorganizmalar belli bir latent devreden sonra bölünerek üremeye başlarlar. Bu dönemin uzunluğu veya kısalığı mikropların türüne bağlı olmakla beraber, çevresel koşullara (pH, ısı, osmotik basınç, yüzey gerilimi, oksijen, vs.), besi yerinin bileşimine, ekilen mikropların ilk alındığı kültürünün dönemine de bağlıdır. İnokulum, bir önceki kültürün durma veya ölme döneminden alınmışsa, veya değişik bileşimdeki besi yerine ekilmişse veya aralarında ısı farkı varsa, bu takdirde uzun veya kısa bir latent dönem oluşabilir. Eğer her iki besi yeri aynı nitelikte ve ekilen mikroplar da bir önceki kültürün üreme döneminden alınmışsa, bu takdirde, latent devre oluşmaz ve mikroplar normal üremelerini sürdürürler.

Ortamda antimikrobial maddelerin bulunması veya hücre bölünmesi için gerekli maddelerin olmaması hallerinde bu faz çok uzun olur veya bölünme olmaz. Latent dönem, şekilde (A) harfi ile gösterilmiştir.

B) Üreme dönemi (logaritmik dönem): Yeterince ve gerekli maddeleri alan, sentezleyen ve latent fazı geçen mikroplar, kendi türlerine özgü bir generasyon süresi içinde ve belli aralıklarla bölünerek çoğalmaya başlarlar. Bakteri sayısı ve bölünme zamanla orantılı olarak artar. E. coli 'de bu süre 18-20 dakika arasında değişmesine karşın, mikobakterilerde 800-900 dakika kadardır. Ancak, aynı tür mikroorganizmalar, üreme döneminde olsalar bile, yine aralarında biraz geç veya biraz kısa süre içinde bölünenler bulunacaktır ve hatta hiçbir bölünmeyenler de olabileceği gibi. Bakteri hücresinin bölünmesi, biyokimyasal aktivite ile de paralellik gösterir.

Bu dönemdeki kültürler, belli zaman aralıklarında sayıma tabi tutulurlarsa üreme eğrisi düz veya dik bir durum gösterir (B). Bu fazda fizyolojik olarak çok aktif olan mikroorganizmalar, fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı çok duyarlıdırlar. Mikroplar, bu dönemde, birçok karakterleri yönünden de bir örneklik gösterirler.

Üreme dönemi çok uzun bir süre devam etmez. Birkaç saat sonra bölünme hızında yavaşlama başlar. Ortamın sınırlı olması nedeniyle gıda ve enerji kaynaklarının sarf edilmesi ve azalması, metabolizma artıklarının ve toksik maddelerin birikmesi, ozmotik basıncın ve yüzey geriliminin değişmesi, oksijenin azalması, besi yerinde bulunan fermente olabilir karbonhidratların ayrışması sonu oluşan çeşitli organik asitlerin ortamın pH 'sını düşürmesi, vs. gibi başlıca faktörler olumsuz yönde etkileyerek üremenin yavaşlamasına sebep olurlar.

Mikroorganizmaları devamlı üreme döneminde tutabilmek için bazı özel aletler, kemostat ve türbidiostat, geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Kemostat, kültüre, mikrobun bölünme durumuna göre, belli aralıklarla damla halinde veya muayyen miktarda taze besi yeri veren ve aynı miktar kullanılmış besi yerini dışarı salan bir alettir. Türbidiostat ise, fotoelektrik yöntemi ile kontrol edilen kültürlerde, üreme sonu oluşan bulanıklık belli bir düzeye ulaşınca, kendiliğinden ortama taze besi yeri veren ve aynı miktar kullanılmış vasatı dışarı çıkaran, bir aparattır.

C) Durma dönemi: Mikropların ürediği sınırlı miktardaki sıvı ortamdaki bozulan optimal koşullar değişmediği veya düzeltilmediği takdirde, üreme giderek yavaşlar. Bakteri populasyonu bir süre sayıca değişmeden kalır ve sonra azalmaya başlar (C). Bu fazda bulunan tüm mikroplarda, bölünme birden durmaz. Bazıları yavaşta olsa, bu uygunsuz koşullara adapte olabilir ve üremelerini sürdürebilir. Ancak, böyle mikropların sayısı, tüm populasyona oranla çok azdır. Durma döneminin uzunluğu veya kısalığı, besi yerinin miktarı, bileşimi, üreyen mikrobun türü ve çevresel koşullara göre değişiklik gösterebilir. S. pneumoniae 'de çok kısa olun bu dönem, E.coli 'de 2-3 gün veya daha fazla olabilmektedir. Durma dönemi uzadıkça mikroorganizmaların morfolojilerinde (involusyon formları), kültürel özelliklerinde (R-formlarının artması) ve fizyolojik karakterlerinde (boyama reaksiyonları, pigment oluşumu, vs.) bazı değişmeler meydana gelir.

D) Ölme dönemi: Durma devresi değişmedikçe, mikroplar bu uygun olmayan koşullar altında ölmeye başlarlar. Populasyon, sayıca giderek, azalır. Ancak, bütün mikroplar ölmeyebilirler. Bazıları canlılıklarını koruyabilir. Bu nedenle de canlılık eğrisi sıfıra ulaşmaz (D). Kültürün steril hale gelmesi mikroplar arasında farklı bir durum gösterir. Örn. S. pneumoniae ve N. gonorrhoea iki üç gün içinde ölür ve otolize olur. E. coli 'de bu süre daha uzun ve M. tuberculosis 'de ise çok daha uzundur (aylar). Ölme döneminde canlı kalabilen mikropların morfolojilerinde değişiklikler meydana gelir (involusyon formları).

Sıvı ortamlarda mikropların ölmesi, aynen ısı ve ultraviolet ışınları etkisi ile ölmede olduğu gibi logaritmik bir tarzda oluşur ve aşağıdaki formül yardımı ile hesaplanır.

(S=S0e-kt )

S0 = Sıfır zamanında canlı mikrop sayısı

S = Belli bir süre (t) sonra canlı mikrop sayısı,

e = Doğal logaritma (2.7182)

k = Ölüm sabitesi

Eşit zaman aralıklarında populasyonun yarısı ölür. Örn. bir kültür de 100 milyon mikrop varsa, belli süre aralıklarından sonra, 50 milyon, 25 milyon, vs. canlı hücre kalır.

Senkron üreme: Saf kültürlerde bulunan mikropların hepsi aynı anda bölünmezler. Bir kısmı bölünürken bir kısmı olgunlaşma dönemindedirler. Ancak, kültürlerde bulunan mikropların, kısa bir süre için, bölünmelerine mani olunabilir veya aynı anda bölünmeleri sağlanabilir (senkron üreme). Bunu sağlamak için bazı yöntemler geliştirilmiştir. Örn. E. coli, timin (DNA'nın bileşiminde bulunan nukleotid bazı) olmayan ortamlarda bölünemezler. Eğer besi yerine bu madde katılırsa, mikropların çoğu aynı anda bölünmeye başlarlar. Bazen de mikroplar düşük sıcaklıkta (15 °C' de) 15-20 dakika tutulduktan sonra hemen optimal ısıya (37 °C' de) bırakılırsa yine aynı tarzda senkron üreme elde edilebilir. Senkron üreme zaman aralıklarıyla uygulanırsa, üreme eğrisi, merdiven basamakları gibi bir durum alır. Filtrasyon yöntemiyle de senkron üreme elde edilebilir.