Genetik materyalin yapısı

Bakterilerin Genetik  Karakterleri

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji

01. Genetik  Materyallerin  Yapısı
02. Prokaryotik  Deoksiribonukleik  Asit (DNA) 
02.01. Pirimidin Bazları 
02.02. Pürin Bazları 
02.03. Pentoz Şekeri 
02.04. Fosfat Grubu 
02.05. Nukleosidler  
02.06. Nukleotidler 
02.07. Polinukleotidler 
02.08. Başlıca DNA Tipleri 
02.09. Diğer Bazı Yapısal Özellikleri 
02.10. Denatürasyon ve Renatürasyon
02.11. Süpersarmal (Süperheliks) DNA Formasyonu 
02.12. DNA'nın Büyüklüğü  
03.Prokaryotik  Ribonukleik Asit (RNA)
 
03.01. Pirimidin ve Pürin Bazları 
03.02.Pentoz Şekeri 
03.03. Fosfat Molekülü 
03.04. Nukleosidler ve Nukleotidler 
03.05. Polinukleotid 
03.06. RNA Türleri 
03.07.Mesenger RNA (mRNA) 
03.08. Transfer RNA (tRNA) 
03.09. Ribosom ve Ribosomal RNA (rRNA) 
03.10. Primer RNA (pRNA)  
04.Prokaryotik   DNA   ile  RNA   Arasındaki  Başlıca  Farklar
 
05.Nukleik  Asitlerin  İn  Vivo ve   İn  Vitro  Fonksiyonları
 
05.01. İn Vivo Fonksiyonları 
05.02. İn Vitro Fonksiyonları  

01. Genetik  Materyallerin  Yapısı

Nukleik asitler, prokaryotik ve ökaryotiklerin, virus, plasmid, faj, transpozon, IS-elementlerinin temel makromolekülünü oluşturduğundan, ayrıca bütün yaşamsal fonksiyonları ve kalıtsal özellikleri de yönettiğinden çok önemli rollere sahiptirler. Bu bölümde daha ziyade prokaryotiklerin (bakteri), virus, plasmid ve faj genomlarının moleküler yapıları ve işlevleri hakkında genel mikrobiyolojiye dayalı, özlü ve temel bilgiler verilecektir.

Nukleik asitler, ilk defa, İsviçreli bir fizyolog olan Friedrich Mischer tarafından 1869 yılında bildirilmiştir. İrin içindeki beyaz kan hücrelerinde proteinlerden ayrı olarak asit karakterde bazı maddelerin de varlığını ortaya koyan araştırıcı, bunlara nuklein adını vermiştir. Çalışmalarını sonraları salmon balıklarının spermatozoidlerinin çekirdekleri üzerinde yoğunlaştıran F. Mischer, bu araştırmalarını 1874 yılında yayımlamıştır. Benzer konularda incelemelerini sürdüren diğer bir bilim adamı da, Richard Altman (1889), asit karakterleri nedeniyle, nukleinleri nukleik asit olarak yeniden isimlendirmiştir. Alman kimyacı, Robert Feulgen, nukleik asitleri, kendi adı ile anılan spesifik bir boyama yöntemi (Feulgen) ile boyamayı başarmıştır (1920). Aynı tarihte, Rockefeller Enstitüsü'nde, Phoebus Levine, nukleik asitlerin yapısında pentoz şekerinin bulunduğunu açıklamıştır. Oswald Avery (1930), nukleik asitlerin (DNA) genetik bir madde olduğunu bildirmiştir.

Watson ve Crick (1953), DNA'nın çift iplikcikli ve sarmal bir yapıya (double-helix) sahip olduğunu belirtmişlerdir. Bu tarihten sonra, gerek prokaryotik ve gerekse ökaryotik DNA üzerinde çok yoğun çalışmalar yapılmaya başlanmış ve halen de aynı hızda devam etmektedir. Bu araştırmalar sayesinde DNA'nın fonksiyonları hakkında çok ayrıntılı ve değerli bilgiler elde edilmiştir. Ayrıca, genetik materyal olarak, RNA ve mRNA üzerinde de benzer tarzda incelemeler yapılmıştır.

Hücrelerdeki bütün biyolojik olayları (fizyolojik, biyokimyasal, genetik vs.) yöneten, genetik bilgiler taşıyarak bunların nesillere aktarılmasında önemli fonksiyonları bulunan nukleik asitler (DNA ve RNA), hücrelerde bir merkezi jeneratör görevine sahip bulunmaktadır. Bu makromolekül, başlıca iki yapısal özellik taşımaktadır.

1) Deoksiribonukleik asit (DNA)  
2) Ribonukleik asit (RNA)  

02. Prokaryotik  Deoksiribonukleik  Asit (DNA)

Bakterilerde DNA, hücre kuru ağırlığının yaklaşık %2-3 kadarını oluşturmakta ve mikroorganizma türüne göre değişmek üzere de 0.01 pg (1 pg= 10-12 g) ağırlığında olabilmektedir. Mikoplasmalarda DNA'nın molekül ağırlığı (MA) 4x108 dalton, hemofiluslarda MA: 8x108 dalton, B. subtilis 'de 3.9x109 ve E. coli 'de 2.6x109 kadardır (1 dalton= 1.67x10-24 g). DNA'nın uzunluğu, E. coli 'de yaklaşık 1.1-1.5 mm kadar olup 4x106 nukleotid çiftinden (baz çifti) oluşmaktadır. Bu uzunluk E. coli 'nin yaklaşık 500 katı kadardır.

Nukleotid birimlerinden (monomer) oluşan ve bir polimer olan DNA'nın yapısında 3 temel komponent bulunmaktadır. Bunlar da;

1) Pirimidin ve pürin bazları,  
2) Pentoz şekeri (2-deoksi-D-riboz)  
3) Fosfat molekülü (fosforik asit, H3PO4)  

02.01. Pirimidin Bazları

DNA'nın yapısında yer alan pirimidin bazları, 4 karbon ve 2 nitrojen atomundan oluşmuş tek halkalı (6 köşeli) bir temel yapı özelliği gösterirler. Bu çatının serbest uçlarına bazı atom veya atom grupları bağlanarak pirimidinler meydana gelmişlerdir. Nukleik asitlerde başlıca iki tür pirimidin bazı bulunmaktadır. Bunlar da, Sitozin (C: 4 amino-2-oksipirimidin) ve Timin (T: (2,4-dioksi 5-metil pirimidin).

Primidin bazlarında oksijen, keto formunda (C=0) bulunur.

Pirimidin ve pürin bazları ile yapıları yandaki şekilde gösterilmektedir.

Pirimidin bazlarından olan Urasil (U: 2,4-dioksi pirimidin) timin yerine RNA'nın yapısında bulunur.  

02.02. Pürin Bazları

Bir pirimidin derivatı olarak kabul edilen pürin bazlarında, biri primidin (6 atomlu) ve diğeri de buna birleşmiş 5 atomlu imidazol halkasından (3 karbon + 2 nitrojen atomu) (meydana gelmiş)  iki halka bulunur. DNA'da iki tür pürin bazı bulunmaktadır. Bunlardan biri, Adenin (A: 6-amino pürin) ve diğeri de Guanin (G: 2 amino; 6 oksipürin)'dir.

Pirimidin ve pürin bazları hidrofobik bir karaktere ve planer bir yapıya sahiptirler. Bazı mikroorganizmalarda (fajlarda) nukleik asitlerin yapısında, yukarıda belirtilen temel bazların yanı sıra minor bazlar  olarak  adlandırılan,  5-metil sitozin (5'-MC) ve 5'-hidroksi metil urasil (5'-HMU) bulunmaktadır.  

02.03. Pentoz Şekeri

DNA'nın yapısındaki ikinci önemli komponenti, 5 karbonlu bir pentoz olan D-riboz (C5H10O5) oluşturur. Ancak, bu şekerin 2. pozisyonunda bulunan karbon atomuna bağlı bir

oksijeni bulunmamaktadır (C5H10O4). Bu nedenle de şeker, 2-deoksi-D-riboz ve nukleik asit de, buna bağlı olarak, deoksiribonukleik asit olarak, adlandırılmaktadır.

Pentoz şekerlerinin ve fosfat molekülünün yapısı yandaki şekilde gösterilmektedir.

02.04. Fosfat Grubu

Nukleik asitlerin (DNA ve RNA) yapısında bulunan 3. komponent de fosfat molekülüdür (H3PO4). Fosfat, hem DNA'da ve hem de RNA'da aynı yapıdadır.  

02.05. Nukleosidler

Nukleosidler: Pirimidin (T,C) veya pürin bazlarından (A,G) birisi ile pentoz şekeri (2-deoksi-D-riboz) birleşerek nukleosidleri meydana getirirler. Her iki molekül arasındaki bağlanma, pentoz şekerinin 1. pozisyonunda bulunan karbon atomunun, pirimidinlerin 3'-pozisyonundaki N-atomu ile ya da pürinlerin 9'-pozisyonundaki N-atomu ile beta glikozid bağları yardımı ile gerçekleştirilir.

Nukleosidler de, orijinlerine göre, pirimidin nukleosidler (timin deoksiribonukleosid ve sitozin deoksiribonukleosid) ve pürin nukleosidler (adenin deoksiribonukleosid ve guanin deoksiribonukleosid) olmak üzere iki kısıma ayrılmaktadırlar.  

02.06. Nukleotidler

Nukleosidler de fosfat molekülleri ile birleşerek nukleotidleri oluştururlar (deoksiribonukleotid). Bu birleşme, pentoz şekerinin 5'-pozisyonundaki karbon atomu ile fosfat molekülünün oksijeni arasında kurulan ester bağı ile sağlanır. Nukleotidler de yapısındaki bazların türlerine göre pirimidin nukleotidler (timin deoksiribonukleotid ve sitozin deoksiribonukleotid) ve pürin nukleotidler (adenin deoksiribonukleotid ve guanin deoksiribonukleotid) olarak iki kısıma ayrılırlar.

Pirimidin nukleotidleri ve pürin nukleotidlerini oluşturan komponentlerin birbirlerine bağlanma tarzları yandaki şekilde gösterilmektedir.

Pirimidin ve pürin nukleotidlerinin birbirine bağlanma tarzları yandaki şekilde gösterilmektedir.

 

02.07. Polinukleotidler

Yan yana bulunan nukleotidler (monomer), birbirleri ile fosfodiester bağları ile birleşerek polinukleotid zincirlerini (polimer) oluştururlar.

Fosfat grubu, bitişik nukleotidin pentoz şekerinin 5' pozisyonundaki karbon atomu ile diğer komşu şekerin 3'-pozisyonundaki karbon atomu arasında fosfodiester (O-P-O) bağı kurar. Bağlantının yönü 5'-P terminusundan 3'-OH terminusuna doğru olduğundan böyle bağlantıya 5'®3' fosfodiester bağı adı verilir. DNA'nın sentezi sırasında nukleotid trifosfatlar pentoz şekerinin 3'-OH ucuna bağlandığından, polinukleotidin büyümesi bu uçtan başlayarak 5®3' yönüne doğru devam eder .

Nukleotid iplikçiklerinin karşılıklı hidrojen bağlantıları yandaki şekilde gösterilmektedir.

Bir bakteri genomunda bu tarzda büyüyen, birbirine karşılıklı hidrojen bağları ile birleşmiş iki adet polinukleotid iplikçiği vardır. Bu iki iplikçikten, birinin  5'-P ucu serbestse, bunun karşısında bulunan diğer iplikçiğin 3'-OH ucu serbesttir. Bu durum, her iki iplikçiğin diğer uçları için de benzeridir. Böylece iki iplikçik bir polariteye sahip olur ve iplikçikler birbirine anti-paralel bir durum gösterirler. Buna göre, iplikçiklerden birinin büyüme yönü 5'®3' ise, diğerinin  büyüme yönü tersine 3'¬ 5' olmaktadır.

Bu tarz bir yapı özelliği gösteren DNA'da, bir iplikçikte bulunan pirimidin bazları (timin, sitozin) diğer iplikçikte bulunan pürin bazları (A, G) ile karşılıklı hidrojen bağları ile birleşmişlerdir. Adenin timinle 2 hidrojen bağı (A= = = T) ve guanin de sitozinle 3 hidrojen bağı (Gº º ºC) ile birleşerek orta eksende yer alırken şeker-fosfat omurgası da dış tarafta bulunur. G ile C arasında 3 hidrojen bağının bulunması nedeniyle, A ile T bağlantısından daha sağlam bir birleşme oluşturur. Karşılıklı birleşmiş olan nukleotidler baz çiftlerini meydana getirirler ve böylece DNA çift iplikcikli, sarmal ve sirküler bir yapı karakteri gösterir.

İki nukleotid iplikçiği, orta eksen etrafında sarmal sirküler (kapalı) ve çift iplikcikli bir yapı karakteri gösteren tek bir moleküldür. Bu strüktür üzerinde biri büyük ve diğeri de küçük olmak üzere iki oluk meydana gelir.

İki nukleotid iplikçiğinin orta eksen etrafında oluşturduğu sarmal yapı ve meydana gelen büyük oluk ile küçük oluklar yandaki şekilde gösterilmektedir.

Bir iplikçikte bulunan pirimidin bazları, karşı iplikçikteki pürin bazları ile birleştiğine göre, DNA'da ne kadar pirimidin varsa o kadar da pürin bazı olacak demektir. Diğer bir ifade ile, sayısal olarak A = T ve G= C olur. Aynı zamanda, A + G = T + C ve A/T = 1 ve G/C = 1'dir. Ancak, A + T/G + C oranı değişik bir durum gösterir. Yüksek hayvan ve bitkilerde bu oranın değeri büyük olmasına karşın, bazı bakteri ve viruslarda büyük veya küçük olabilmektedir. Örneğin C. perfringens 'de A + T/G + C = 70/30 ve A. bovis 'de ise 26/74'dür.

Dört temel bazın (A,T,G,C) değişik sırada yan yana ve karşılıklı birleşmesinden oluşan DNA iplikçikleri hücreler ve canlılar için çok önemli olan genetik bilgileri taşırlar ve bu bilgiler bazların diziliş sırası ile yakından ilgilidirler. Orta eksende yer alan bazlar bu bilgilerin korunmasını güvence altına almış olurlar. Aynı türün DNA kompozisyonu (diziliş sırası ve sayısı) birbirinin aynıdır, sabittir ve değişmez. Farklı türlerin DNA'ları birbirine uymaz. Bu durum türler arası genetik farklılıkları oluşturur. Genetik düzeyde oluşan değişmeler (mutasyonlar), yeni nesillerde farklı fenotipik karakterde bireylerin meydana gelmesine neden olurlar (mutant). Ancak, normal koşullar altında böyle olgular çok nadirdir (10-7-10-10 gibi).

Bir iplikçikte bulunan baz türü ve sırası karşı iplikçikteki baz türünü ve sırasını da belirler ve böylece birbirini bütünler ve tamamlar (komplementer) bir karakter gösterirler. Bu duruma göre, bir iplikçikteki baz türü ve sırası: AT G C C C... A ise, karşı iplikçikleri T A C G G T .....T bazları bulunması gerekecektir.

DNA'nın sarmal ve özellikle, çift iplikcikli olmasının önemi çok fazladır. Çift iplikcikli olmakla genetik bilgiler garanti altına alınır ve güvenceleri sağlanır. Ayrıca, DNA kendine bir replikasyon mekanizması kurarak, bir iplikçik diğerinin sentezi için kalıp ödevi görebilecek duruma gelir. Bir iplikçikte oluşan kopma ve zedelenmeler, sağlam olan karşı iplikçik kalıp olarak kullanılarak, kopan yerdeki bazların yerine polimeraz enzimi tarafından yenileri yerleştirilir. İplikçiklerin her biri aynı genetik bilgilere sahip olduğundan transkripsiyonda sadece bir iplikçik görev alır ve bu da, 3¬ 5' yönünde olanıdır.  Baz çiftleri, aynı zamanda, replikasyonun doğru yönde ilerlemesine de yardımcı olurlar.

Polinukleotid iplikçiklerinde bulunan 4 bazın (A,T,G,C) diziliş sırasında çok önemli bilgilerin şifreleri (genetik kodlar) saklı olarak bulunur. Bu bazlardan yan yana bulunan 3 tanesi bir amino asitin kodunu oluşturur (triplet veya kodon). Bu üçlü sistemde 64 (43) kodon bulunmaktadır. Bu duruma göre, 20 amino asit için 64 kodon vardır ve her bir amino asit için de en az bir veya birden fazla kodon bulunacak demektir. Örneğin, fenil alanin için UUU ve UUC, serin için UCU ve UCC veya valin için GUU, GUC, GUA ve GUG gibi birden fazla triplet fonksiyon yapar. Eğer, her amino asit için 2 bazdan oluşan bir kodlama olsaydı, 20 amino asit için 16 (42) kodon bulunacaktır ve bu sayı da yetersiz kalacaktır. Böylece, 3 baz olmakla veya kodon sayısı artmakla her amino asit için hem seçenek ve hem de spesifite arttırılmış oluyor. Kodonlar arasında UAA, UAG ve UGA gibileri hiçbir amino asitin şifresi olmayıp bunlar translasyonda, sentezlenen peptidin bitişinin sinyalini veren kodonlardır.

Bir bakteride genetik kodlar ve özellikleri şöyledir.

1) Kodonlar triplettir: Genetik bilgileri saklayan kodlar, 3 bazın birleşmesinden meydana gelmişlerdir.

2) Kodonlar değişkendir: Her amino asit için bir veya birden fazla triplet bulunmaktadır. Örn., fenilalanin için UUU ve UUC, serin için UCU ve UCC, vs. birden fazla kodon bulunur. Bu örnekleri daha da çoğaltmak mümkündür.

3) Kodonlar birbirlerine çakışmazlar: Bir triplette bulunan bazlar, aynı anda, başka bir amino asitin kodonu olamaz. Diğer bir ifade ile aynı harflerle oluşan bir kodon, ancak bir amino asitin şifresini teşkil eder. Ayrıca, yan yana bulunan bazlardan biri, bir önceki veya sonraki amino asitin kodonunun bir harfini (bazını) oluşturamaz. Bu nedenle, kodonlar birbirlerinden tam bağımsızdırlar.

4) Kodonlar arasında boşluk yoktur: Prokaryotik mikroorganizmalarda (bakterilerde) kodonlar DNA veya mRNA üzerinde yan yana aralıksız olarak devam ederler. İki triplet arasında herhangi bir baz(lar) veya sekans bulunmaz ve bu nedenle arada intron (kodlamayan sekans) yoktur. Bu durum, genler için de geçerlidir. Buna karşın, viruslarda ve ökaryotiklerde, birbirleriyle ilişkili genler olsa bile, bazen aralarında 2000 veya daha fazla bazlık kodlamayan sekanslar (intron) bulunmaktadır. Ancak, DNA'dan mRNA sentezlenirken bu intronlar primer mRNA' ya aktarılmasına karşın, olgun mRNA'nın meydana gelmesinde intronlar çıkarılır ve sadece kodlayan genler (eksonlar) yan yana getirilerek birleştirilir ve böylece translasyon için sadece olgun mRNA kullanılır.

5) Kodonlar üniversaldir: Bir triplet, bakteride hangi amino asitin şifresi ise, ökaryotiklerde ve diğer organizmalara ait DNA'lar da aynı amino asitin kodonudur. Bu durum da, canlıların genetik materyallerinin amino asit şifrelemesi yönünden birbirlerinin benzeri olduğunu göstermektedir. Ayrıca, baz türlerinin de hemen hemen aynı olduğunu anlamak mümkündür.

Bakterilerde DNA, iki adet polinukleotid iplikçiğinin sarmal bir tarzda karşılıklı birleşmesinden oluşmuş ve sirküler bir yapı karakteri gösterir (double heliks, çift sarmal). Aynı zamanda, bu polinukleotid iplikçiğinin iki ucu da kapalıdır (sirküler) ve tek bir molekül halindedir. Uzunluğu, bakterilerin türlerine göre değişmek üzere, bakteri boyunun 400-500 katı kadardır (1.1-1.5 mm). Ancak, B. burgdorferi 'de lineer bir kromozomun olduğu bildirilmiştir.  

02.08. Başlıca DNA Tipleri

Mikroorganizmalarda bir çok tipte DNA bulunabileceği belirtilmiştir. Ancak, bunların çoğu deneysel koşullarda rastlanan tiplerdir (A, B, C, D, E ve Z gibi). Bu formların saptanmasına temel teşkil eden esaslar kısaca şöyledir.

1) Heliksin bir tam dönümüne isabet eden baz sayıları,  
2) Orta eksen etrafında bulunan baz çiftlerinin birbirlerine olan açıları,  
3) Molekülün çapı,  
4) Omurganın (fosfat + şeker) sağa veya sola dönüş durumu.

Yukarıdaki kriterlerin ışığı altında, prokaryotiklerde (bakterilerde) rastlanan en önemli DNA tipleri 3 tanedir. Bunlar da,

B-DNA tipi: Watson-Crick modeli DNA, bu tür için en iyi bir örnektir. Bu tür doğal DNA'nın şeker-fosfat omurgası düzgün ve sağa dönüşlüdür. Sarmal dubleksin çapı 2.0 nm, her bir 3.4 nm'de tam bir dönüş yapar ve her bir dönüşe 10 nukleotid çifti isabet eder. Her bir baz çiftinin kalınlığı 0.34 nm olup bazlar orta eksene dikeydir ve bazlar arasında (birbirine bitişik nukleotidler arasında) orta eksene göre 36°’lik bir açı vardır.

A-DNA tipi: Deneysel koşullarda elde edilen bu tip DNA, süspansiyon halinde iken suyun çıkarılması (dehidrasyon) durumunda ve %70-75 etanol içinde meydana geldiği açıklanmıştır. Böyle ortamlarda DNA'da büzülmeler oluşmakta ve her bir tam dönüşe 11 baz çifti isabet etmektedir. Sağa dönüşlü bir omurgası bulunan A-DNA'da bazlarının kalınlığı 0.26 nm, orta eksene göre bazlar arasında 33°'lik açı  bulunmakta ve tam bir dönüş 2.8 nm uzunluktadır. Heliksin çapı 2.3 nm kadardır.

DNA formları yandaki şekilde gösterilmektedir.

Z-DNA tipi: Bu DNA tipi de çift iplikcikli ve sarmal bir yapı özelliği taşımasına karşın omurgası zigzaglı ve sola dönüşlüdür. Bu tür DNA'da bir tam dönüşe 12 baz çifti (6 dimer) isabet eder. Bazların kalınlığı 0.37 nm ve heliksin kalınlığı ise 1.8 nm kadardır. Tam bir dönüş 4.5 nm olup her dimer arasında -60°lik açı vardır.  

02.09. Diğer Bazı Yapısal Özellikleri

Nukleik asitlerin, proteinlerde de belirlendiği gibi, bazı yapısal özellikleri bulunmaktadır.

1) Nukleik asitlerin primer yapıları: Nukleik asitlerin komponentlerinin birbirlerine bağlanma özellikleri (anti paralellik, 5'®3' ve 3'®5' yöndeki bağlantıları, 5'-ucunda P ve 3'-ucunda OH molekülünün bulunması, bazların genetik informasyon taşımaları, 4 bazdan oluşma durumu, vs)

2) Nukleik asitlerin sekonder yapıları: Bu yapı içinde, nukleik asitlerin sarmal yapıları, her sarmala isabet eden baz sayıları, karşılıklı bazlar arası hidrojen bağları, DNA'nın yapısı (A, B, Z DNA formları), vs bulunmaktadır.

3) Nukleik asitlerin tersiyer yapıları: Bu kavram içinde DNA'nın sirküler, lineer ve süpersarmal formları yer almaktadır.  

02.10. Denatürasyon ve Renatürasyon

Bakterilerden saf olarak elde edilen DNA süspansiyonu 100°C 'ye kadar yavaş yavaş ısıtılırsa (veya kimyasal yöntemlerle) bazlar arasındaki karşılıklı hidrojen bağlarında çözülmeler meydana gelerek iki iplikçik birbirlerinden ayrılabilir (denatürasyon). Eğer bu süspansiyon, yavaş yavaş soğutulursa bu defa da karşılıklı hidrojen bağları tekrar kurulur ve molekül eski formunu alır (renatürasyon). DNA'nın bu özelliğinden yararlanılarak suni veya melez (hibrid) DNA molekülleri oluşturmak (hibridizasyon) ve bunları çeşitli araştırmalarda, mikroorganizmaları sınıflamada, gen transferlerinde veya diğer genetik manipulasyonlarda kullanmak olanak dahiline girmiştir. Hibridizasyon denemelerinde çok yararlanılan böyle çalışmalarda, hibrid moleküller oluşturmak ve sonra da bunları işaretli problarla saptamak mümkündür.

Normal DNA ve denatüre DNA yandaki şekilde gösterilmektedir.

02.11. Süpersarmal (Süperheliks) DNA Formasyonu

Prokaryotiklerin (bakteriler) DNA'ları başlıca 2 topolojik formda bulunmaktadır.

a) Sirküler dubleks DNA formu: Bakteriler, bazı fajlar (PM2, vs.), iplikcikli sarmal sirküler bir karaktere sahiptir.

b) Süpersarmal (süperheliks) DNA formu: Fajlarda, plasmid ve viruslarda daha fazla rastlanılan bu form, dubleks sarmal DNA'nın serbest ortamda kendi ekseni etrafında 360° ve birkaç kez dönmesinden kaynaklanmaktadır.

Sirküler dubleks ve süpersarmal DNA formu yandaki şekilde gösterilmektedir.

Süpersarmal DNA formuna daha ziyade sirküler sarmal DNA' larda fazlaca rastlanılmaktadır. Süperheliks formları önceleri küçük DNA moleküllerinin (virus, faj, plasmid, mitokondrial DNA, vs) özel bir karakteri olarak düşünülmüştür. Bazı araştırmacılar da, DNA izolasyonları sırasında oluşan artifaktlar olarak kabul etmişlerdir. Bugün ise, bu formların prokaryotik hücrelerin (ve ayrıca faj, virus, plasmid) DNA'larının önemli bir karakteri olduğu, replikasyon, transkripsiyon ve rekombinasyonlarda fonksiyonlarının bulunduğu anlaşılmıştır.

Süpersarmal DNA’nın formları yandaki şekilde gösterilmektedir.

Süpersarmal DNA, ya sola dönüşlü pozitif süpersarmal veya sağa dönüşlü negatif süpersarmal formda bulunabilir. İn vivo koşullarda ise daha ziyade negatif süpersarmala rastlanılmakta ve DNA üzerine de torsiyonal bir stres yaratarak açılmasını kolaylaştırmaktadır. Buna karşın, pozitif süpersarmal daha sağlam ve sıkı yapısal bir özellik taşımaktadır. Bir DNA'da, çok sayıda sarmal oluşabilir. Aynı zamanda, süpersarmal form, DNA'nın santrifüjde daha çabuk çökmesini de sağlar.

Hücrelerde süpersarmalın varlığı bazı tekniklerle ortaya konulabilir.

1) Elektron mikroskopla direkt muayene: Hücrelerden elde edilen DNA'nın (virus, faj, plasmid, vs.) elektron mikroskopla direkt muayenesi ile süpersarmal durumu kolayca görülebilir. Bu tarzda fotoğrafları çekilmiş bir çok DNA'nın süpersarmal formları gözlenmiştir.

2) Sedimentasyon metodu: Gerek pozitif ve gerekse negatif süpersarmal DNA'lar sirküler ve sarmalsız olanlardan daha çabuk çökme özelliğine sahiptirler. Bu nedenle de süpersarmal DNA'lar santrifüj tüpünün dibinde ve sadece sirküler olanları da bunun üstünde bulunurlar.

3) Elektroforezis yöntemi: İzole edilen DNA'lar agarose jele konarak elektroforezise tabi tutulursa, süpersarmal DNA'lar ile istirahat halinde olanlar veya süpersarmal içermeyenler birbirlerinden kolayca ayırt edilebilirler. Süpersarmal DNA'lar daha ileride bir lokalizasyona sahip olmalarına karşın, diğerleri başlangıç noktasına yakın bulunurlar.

DNA molekülünün negatif veya pozitif süpersarmal bir duruma gelmesinde ve bu sarmalarının açılarak istirahat formunu almasında Topoisomeraz olarak adlandırılan enzimlerin rolü bulunmaktadır. Bu enzimler de başlıca iki tane olarak saptanmıştır.

Topoisomeraz-I: Yaklaşık 100000 molekül ağırlığında olan ve monomerik bir yapıya sahip olan bu enzim (Topo-I) negatif süpersarmal DNA molekülünün tek bir iplikçiğinde ve geçici bir süre için kopmalar ve tekrar birleşmeler yapar. Enzim, süpersarmal DNA'yı açarak istirahat formuna dönüştürür. Bu fonksiyonu için enerjiye gereksinim duyulmaz. Enzim, DNA iplikçiklerinden birine bağlanarak kopma (veya açılma) yapar ve ikinci sağlam DNA iplikçiğinin bu açıklıktan geçmesini sağlar. Sonra, ayrılan iki uç enzimle hemen kapatılır. Bu

açılma ve kapanma, DNA molekülünde herhangi bir zarar meydana getirmez. Topo-I enzimi pozitif süpersarmal DNA'da aynı tarzda etkili değildir.

Topoisomeraz II: Bu enzim (Topo-II), ATP'den enerji sağlayarak, süpersarmal DNA'nın her iki iplikciğinde kısa bir süre için kopmalar (açılmalar, çentikler) yaparak molekülü istirahat haline getirir.

Bakterilerde (E. coli, vs.) bulunan ve bu sınıfta yer alan Topo-II enzimi, DNA giraz (gyrase), daha ziyade istirahat halinde bulunan DNA molekülünü negatif süpersarmal haline getirir. Diğer bir ifade ile DNA giraz enzimi, süpersarmal haline gelmeyi katalize eden bir fonksiyona sahip bulunmaktadır. DNA'da oluşan çentikler çok kısa bir süre içinde hemen kapatılarak zararlı etki yapması önlenir. Bir molekül DNA giraz 30°C 'de her dakikada yaklaşık 100 süpersarmal oluşturabilmektedir. Enzim 400000 molekül ağırlığında ve tetramerik bir yapıdadır (A2B2). Hücrelerde A alt ünitesinin B'den 10 defa daha fazla olduğu açıklanmıştır.

DNA giraz enziminin bakterilerde replikasyon çatalının ilerlemesinde çok önemli fonksiyonu bulunmaktadır. Bu enzimin inhibisyonu, DNA'nın replikasyonunu durdurur ve bakteride ölümlere yol açar. Bu enzimin aynı zamanda transkripsiyon ve rekombinasyonda da işlevleri bulunmaktadır.

Bazı antibiyotikler DNA giraz'ı inhibe etmektedirler: Giraz A, nalidixic acid ve oxilinic acid ve giraz B'de coumermycin ve novobiocin tarafından inhibe edilir.

Plasmidlerde (ColEI, pBR322, vs.), fajlarda (OX174, vs) ve viruslarda (SV40, polyoma, vs.) süpersarmal oluşumuna rastlanılmıştır.  

02.12. DNA'nın Büyüklüğü

Bakterilerdeki DNA'nın uzunluğu oldukça değişiktir. DNA'nın yaklaşık ağırlığı 0.01 pg kadardır. (1 pico gram = 10-12 g). E. coli 'de 4x106 nukleotid çifti bulunur ve moleküler ağırlığı da 2x109 daltondur. E. coli 'de DNA'nın uzunluğu 1.1-1.5 mm olup bakteri boyunun 400-500 katıdır. Diğer bakterilerde ise bu ölçüler değişik bir durum gösterir. T2 fajının DNA'sı faj boyunun 500 katı olup moleküler ağırlığı 2x106 daltondur. Küçük bakteri viruslarından olan Ø X174 DNA fajının genomunda yaklaşık 5386 baz çifti bulunur (M.A. 1.6x106).

E. coli 'de yaklaşık 3000 kadar genin bulunduğu tahmin edilmiştir. Bunlardan ancak 1000'den fazla genin yeri saptanabilmiştir. E.coli 'de bir gene isabet eden baz çifti sayısı 4 x 106 / 3000 = 1333 (1400)'dür. Bir gende 1400 baz çifti bulunduğuna göre, 1400/3 = 470 kadar kodon ve yaklaşık 470 amino asitlik bir proteini sentezleyebilecek demektir. E.coli 'de 4x106 baz çiftinin kodları yan yana yazılsa bir sayfaya 1000 harf (baz) konsa, yaklaşık 4000 sayfalık bir kitap veya her biri 400 sayfalık 10 cilt kitap meydana gelecek demektir. İnsanda kromozom sayısı 46 olduğu için yaklaşık 460 cilt kitap  eder. B-DNA formunda yan yana bulunan bazlar birbirinden 0.34 nm mesafede olduğuna ve ortalama boyda bir gende yaklaşık 1400 baz bulunduğuna göre bir genin uzunluğu 1400x0.34 = 476 nm'dir. Bir nukleotid çiftinin molekül ağırlığı yaklaşık 261 dalton olduğuna göre, bir genin molekül ağırlığı da 261x1400 = 365400 dalton kadardır.  

03.Prokaryotik  Ribonukleik Asit (RNA)

Mikroorganizmalarda, DNA'dan ayrı olarak hücre içinde çok önemli fonksiyonlara sahip olan diğer bir makromolekül de ribonukleik asit (RNA)'dır. Kompozisyonu bakımından DNA'ya çok benzerlik göstermesine karşın fonksiyonel olarak farklı bir aktiviteye sahiptir. Bazı araştırıcılar RNA'yı tam bir genetik materyal olarak kabul etmemekte, biri genetik RNA (genellikle, mRNA ve RNA virusları) ve diğeri de nongenetik RNA (diğer RNA'lar) olmak üzere iki ayrı molekül olarak düşünmektedirler.

Bakteriyel RNA'nın yapısı da başlıca 3 komponentten oluşmaktadır.

1) Pirimidin ve pürin bazları  
2) Pentoz şekeri (D-riboz)  
3) Fosfat molekülü (fosforik asit)  

03.01. Pirimidin ve Pürin Bazları

RNA'nın yapısında pirimidin bazlarından Sitozin (C) ve Urasil (U: 2,4-dioksipirimidin) bulunur. Urasil, DNA'daki timinin yerini alır. Diğer bir ifade ile RNA'da timin yoktur. Urasil, yapı bakımından timine çok benzer. Ancak timinde 5'pozisyonunda bulunan metil grubu (CH3) yerine urasilde hidrojen (H) bulunur. Pürin bazları aynen DNA'da olduğu gibi 2 tanedir (Adenin ve Guanin).  

03.02.Pentoz Şekeri

RNA'nın bileşiminde bulunan pentoz şekeri D-riboz (C5H10O5) yapısındadır.  

03.03.Fosfat Molekülü

RNA molekülünde DNA'daki gibi aynı H3PO4 molekülü vardır.  

03.04. Nukleosidler ve Nukleotidler

Nukleosidler pirimidin bazları (sitozin, urasil) ve pürin bazlarından (adenin, guanin) biri ile pentoz şekerinin (D-riboz) birleşmesinden meydana gelmiştir. Bazların şekerle birleşmesi aynen DNA'da olduğu gibidir.

Nukleosidler, pirimidin nukleosid ve pürin nukleosid olarak iki grupta toplanabilirler.

Nukleotidler, nukleosidlerle fosfat molekülünün birleşmesinden oluşmuşlardır (pirimidin nukleotidler ve pürin nukleotidler).  

03.05. Polinukleotid

Nukleotidlerin fosfodiester bağlarıyla birleşmesinden polinukleotidler meydana gelirler.

DNA'nın aksine, RNA tek iplikçik halindedir. Bu nedenle de DNA'ya oranla daha zayıftır ve kolay tahrip olur. Ancak, molekül bazı bölgelerde kendi üzerine katlanarak sağlam yapı oluşturur. Bu birleşme adenin ile urasil ve guanin ile sitozin arasında gerçekleştirilir.  

03.06. RNA Türleri

Bakterilerde hücre içindeki fonksiyonları, molekül ağırlıkları, sedimentasyon konstantları, birbirinden farklı 4 tür RNA bulunmaktadır. Bunlar da;

1) Mesenger RNA (mRNA) (genetik)  
2) Transfer RNA (tRNA)  
3) Ribosomal RNA (rRNA, nongenetik)  
4) Primer RNA (pRNA, nongenetik)  

03.07.Mesenger RNA (mRNA)

DNA iplikçiklerinin birinden, RNA polimeraz enziminin (DNA'ya bağımlı transkriptaz) katalitik etkisi ile, genetik bilgiler mRNA'ya aktarılır (transkripsiyon). Yeni oluşan mRNA, kendisinin sentezine kalıplık yapan DNA iplikçiğine anti paralel bir durum gösterir (M.A. 500.000'in üzerindedir.)

Mesenger RNA, tek iplikçik, düz ve iki ucu açık olup yapısında A,U,C ve G bazları bulunur (timin yoktur). E. coli 'de mRNA'nın 6000 nukleotidden fazla olduğu tahmin edilmiştir. Hücre içinde RNaz'lar tarafından kolayca tahrip edilen mRNA'nın ömrü 2-3 dakika kadardır. mRNA'nın 5'-ucunda translasyonu başlatma sinyalini veren 30S'lik ribosomal alt üniteye bağlanan AUG kodunu ile SD sekansları bulunur. Bu AUG kodonu, formilize olmuş metionin tRNA'nın bağlanma yeridir. Halbuki, mRNA'nın iç kısmında bulunan AUG kodonu ise sadece met tRNA'nın spesifik tripletidir.

Mesenger RNA'da AUG başlama kodonundan sola doğru, Shine Dalgarno (SD) sekansları olarak bilinen nukleotid sıraları bulunmaktadır. Bunlar mRNA'nın 30S ribosomal alt ünite üzerine sağlamca tutunmasında rolleri fazladır.  

03.08. Transfer RNA (tRNA)

Protein sentezinde önemli fonksiyona sahip olan, ribosom üzerinde sıraya giren kodonların amino asitlerine, amino acyl senthetase ile aktive olduktan sonra, bağlanarak onları ribosomlardaki kodonuna taşıyan ve sıraya koyan küçük bir moleküldür (75-85 nukleotid). Her amino asite özel bir veya birden fazla tRNA vardır. Amino acil sentetaz tarafından aktive edilen amino asitler yüksek enerji ile tRNA'nın 3'-OH (CCA) ucuna bağlanırlar. tRNA için, hücre içindeki fonksiyonuna göre 4 yapraklı bir yonca (4 kollu) benzeri morfolojisi tanımlanmaktadır. Bu kolların hepsinin ayrı işlevi vardır. Bunlardan en önemlisi, antikodon olarak fonksiyonu olanıdır. Bu bölge, ribosom üzerinde sırada bulunan kodonu tanıyarak bağlanır ve bu kodona tekabül eden amino asiti de birlikte taşır.  

03.09. Ribosom ve Ribosomal RNA (rRNA)

Üremekte olan hücreler de sayıları yaklaşık 15000-30000 kadar bulunan ribosomların amino asitlerin birbirleriyle birleşmesinde ve protein haline dönüşmesinde rolü çok büyüktür. mRNA, 30S alt ünitenin oluğuna yerleşir ve 50 S'lik ribosomla birleştikten sonra oluşan 70 S ribosom, mRNA üzerinde kayar ve her kayışta bir kodonu sıraya koyarak ilerler.

Ribosomların yaklaşık %60 RNA ve %40'ı da spesifik proteinlerden oluşmaktadır. E. coli 'de başlıca 3 tür rRNA bulunur (5SrRNA, 23SrRNA, 16SrRNA).

Ribosomların küçük alt ünitesi (30S), mRNA'da bulunan AUG ve Shine-Dalgarno sekanslarına bağlanmada önemi ve etkinliği fazladır.  

03.10. Primer RNA (pRNA)

DNA'nın replikasyonu sırasında parental iplikçiğin 5'®3' yönünde olanına yeni iplikçik sentezlenirken bunun sentez yönü tersine 3'¬5' olacağından, DNA polimeraz enzimi ters olan bu yönde sentezi kesintili olarak sürdürür. Önce, primaz  (RNA polimerase) enzimi tarafından 50-100 nukleotidden oluşan primer RNA'lar sentezlenir. Bunlar basamak olarak kullanılarak kısa DNA sekansları (Okazaki segmentleri) oluşturulur. DNA pol.I enzimi yardımı ile araları doldurulur ve DNA ligaz ile de birleştirilir. pRNA'ların görevi bittikten sonra DNA polimerase tarafından dijeste edilerek çıkarılırlar. Bu RNA, bakterideki dnaG geni tarafından kodlanır.  

04.Prokaryotik   DNA   ile  RNA   Arasındaki  Başlıca  Farklar

1) DNA genellikle çift iplikciklidir. RNA ise tek iplikciklidir.  
2) DNA'da pentoz şekeri 2-deoxy D-riboz  (C5H10O4) tarzındadır. Yani, pentoz şekerinin 2 pozisyonundaki karbon atomuna bağlı sadece (H) molekülü bulunur, oksijen yoktur.  
Buna  karşın RNA  D-riboz karakteri  taşır (C5H10O5).  
3) DNA'da Timin vardır. Bunun yerine RNA'da Uracil bulunur.  
4) Fosfat molekülü her iki nukleik asitte de aynı yapıdadır (H3PO4).  
5) DNA molekülü, genellikle çift iplikcikli olması nedeniyle, RNA'dan daha sağlam yapısal bir bütünlük gösterir. Ancak, tek iplikçik olan RNA'da kendi üzerine kıvrımlar yaparak çift iplikcikli kısa formlar meydana getirmekte ve yapısını sağlamlaştırmaktadır.  
6) RNA molekülü, alkalilerle 2-3-cyclic diesterlere ayrışabilmektedir.  
7) RNA'da guanin ve sitozin miktarları eşit değildir.  
8) RNA-RNA dupleksi, RNA-DNA dupleksinden daha sağlamdır.  
9) RNA'daki baz sıraları, kendinin transkripsiyonunda görev alan DNA'daki baz sıralarına komplementerdir.  
10) Dubleks DNA süperheliks form oluşturabilir.

Ökaryotiklerde, mRNA molekülünün 5-ucunda 7-metilguanosin trifosfat (kep) ve 3' -ucunda da poli A (AAAA....A) bulunur. Ancak, viruslarda da böyle durumlar bulunmaktadır. Böyle olguya,  prokaryotik (bakterilerde) mRNA'da rastlanamaz.

Prokaryotiklerin mRNA'sı polisistronik (bir çok genin kodlarını taşır) olmasına karşın, ökaryotiklerin mRNA'sı monosistroniktir (tek bir genin kodlarını taşır).  

05.Nukleik  Asitlerin  İn  Vivo ve   İn  Vitro  Fonksiyonları

05.01. İn Vivo Fonksiyonları

Nukleik asitlerin (DNA veya RNA) hücrelerde çok önemli vital fonksiyonları bulunmaktadır. Genetik materyallerin, canlılarda kalıtsal karakterleri taşıması ve nesillere transferi gibi görevleri yanı sıra, hücrelerdeki bütün fizyolojik, biyokimyasal, metabolik, morfolojik, antijenik, v.s. özelliklerin belirlenmesinde de önemli görevlere sahiptirler. Bunlardan ayrı olarak da, genetik materyaller, enerji taşımaları, enzimlerin kofaktörleri olmaları, kimyasal mesenger oluşturmaları, nukleik asitlerin sentetik analoglarının kanser sağaltımında ve viral infeksiyonlarında önleme amacı ile kullanılması gibi etkinlikleri de bulunmaktadır.

Bu son aktiviteleri hakkında aşağıda kısa ve özlü bilgiler verilmektedir.

1) Nukleotidler kimyasal enerji bağları taşırlar: Nukleik asitlerin yapısında fosfat moleküllerinin bulunması nedeniyle yüksek enerjiye sahip makromoleküllerdir. Bu enerji, hücrelerde, bir çok biyokimyasal olgularda ve özellikle, biyosentezde fazlaca kullanılırlar. Nukleotidlerde, 1, 2 ve 3 adet fosfat grubu bulunabilir (NMP, NDP ve NTP). Bunlar içinde en önemlisi ve fazla kullanılanı 3 fosfat molekülü taşıyan Adenosine trifosfattır (ATP). Diğerleri (UTP, GTP ve NTP) ise bazı spesifik reaksiyonlarda gerekli olmaktadırlar.

Hücre içinde, biyosentez olaylarında fonksiyonları bulunan ve yüksek enerjiye sahip makromoleküllerden olan nukleik asitler, yapılarında pürin ve pirimidinin yer alması nedeniyle de DNA ve RNA'nın monomerik prekürsörlerini de oluştururlar.

2) Nukleotidler birçok enziminin de kofaktörleridir: Hücre içinde çok önemli ve hayati rollere sahip olan enzimlere ait kofaktörlerin yapısında da nukleotidler bulunur. Böylece enzimlerin aktivasyonunda ve fonksiyonel bir duruma gelmelerinde nukleotidlerin önemi oldukça fazladır. Örn, koenzim A (3' -fosfoadenin difosfat (PADP); nikotinamid adenindinukleotid (NAD); flavin adenindinukleotid (FAD) bunlar arasındadır.

3) Bazı nukleotidler hücrelerde sinyal iletişiminde sekonder mesenger görevi yaparlar: Hücrelerde, nukleotidlerin diğer önemli fonksiyonları arasında bazı sinyalleri transferde sekonder mesenjer görevi yapmaları da bulunmaktadır. Bunlardan en önemlisi, cyclic adenosine monophosphattır (cAMP). Buna karşın guanosine monophosphatın (GMP) etkinliği daha zayıftır. cAMP, adenilate siklase enziminin katalitik aktivasyonu sonu ATP'den elde edilir.

4) Sentetik nukleotid analogları klinik hekimlikte fazlaca kullanılma alanı bulmuşlardır: Pürin ve pirimidinlerin sentetik analogları onkolojide ve viral infeksiyonların sağaltımında, son yıllarda fazlaca yararlanılan kimyasallar arasında yer almaktadırlar. Bu bileşikler, ya nukleik asit sentezinde önemli fonksiyonları olan enzimlerin inhibisyonunu sağlayarak veya nukleik asitlerin yapısına girerek, etkilerini gösterirler. Bunlar arasında, 5-fluorouracil (5-FU); 5-iodo-2-deoxyurdine; 6-mercaptopurine; 6-thioguanine 5- veya-6-azauridine; 5-veya-6-azacytidine; 8-azaguanine; allopurinol; cytarabine; azathiopurine, vs. bulunmaktadır.

5) Nukleotidler oksidatif fosforilasyon reaksiyonunda adaptör olarak (ATP) görev yaparlar.

6) DNA ve RNA'nın yapısını oluşturan nukleotidlerin, genetik bilgileri taşıdıkları ve transfer ettikleri için de önemlileri çok fazladır.  

05.02. İn Vitro Fonksiyonları

Nukleik asitlerin in vitro bir çok önemli çalışmalarda da rolleri bulunmaktadır. Bunlar kısaca şöyle sıralanabilirler.

1) Hibridizasyon denemelerinde (türlerin sınıflandırılmalarında, genlerle ilgili çalışmalar da, vs)  
2) Rekombinant DNA teknolojisinde  
3) Hastalıkların teşhisinde  
4) Genlerin haritalarının yapılmasında  
5) Diğer biyoteknolojik çalışmalarda

Kaynak: Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 69008 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader