Mikroskoplar İçin Preparat Hazırlanması

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1

01. Genel Bilgiler

Mikroorganizmaları mikroskop altında iyice görebilmek ve identifikasyonlarına yarayacak bazı bilgileri (hareket, spor, kapsül, şekil, boya reaksiyonları, v.s.) elde edebilmek için, hem boyamadan ve hem de boyanarak muayeneleri gereklidir. Bu amaçla, kültürlerden veya marazi maddelerden, usulüne uygun olarak preparatlar hazırlanır ve incelenir. Muayeneler çok yönlü olduğundan, hazırlanacak preparatların da inceleme bakımından değişik tarafları olmaktadır.

02. Hareket Muayenesi İçin Preparat Hazırlanması

Mikroorganizmalar kendilerinde bulunan flagellalar yardımı ile aktif hareket ederler ve yer değiştirirler (Salmonella, E. coli, P. vulgaris, P.aeruginosa, C. septicum vs.). Diğer bir kısmı da flagellaya sahip dağildir (S. gallinarum, S. pullorum, stafilokok, streptokok, B. anthracis, M. tuberculosis, C. pyogenes, vs.) ve bu nedenle aktif hareket edemezler (yer değiştiremezler). Ancak, bunlar bulundukları yerde moleküler harekete (Brownian) sahiptirler. Bazı mikroorganizmalar da flagellaya sahip olmamasına karşın, bükülerek, kıvrılarak, sürünerek, vs aktif hareket edebilirler (myxobacter'ler, leptospiralar).

Hareket muayenesinde, mikroorganizmaların gerçek harekete (yer değiştirme ile beliren hareket) sahip olup olmadıklarını saptarken dikkatli bulunmalıdır. Bazı mikroplar, flagellalı olmasına karşın, pasif bir hareket gösterebilirler. Bazı hareketsiz veya flagellasız mikroorganizma kültürlerinde de flagellaya sahip mutantlar oluşabilir ve bu nedenle de aktif hareket saptanabilir. Bazen de, lâm-lâmel arası muayenelerde sıvı içinde kayma ve akmalar görülebilir. Bunları tecrübeli elemanlar kolayca ayırt edebilirler.

Hareket muayenelerinin yapılmasında birkaç yöntem bulunmaktadır. Bunlar arasında laboratuvarlarda en çok kullanılanları kısaca aşağıdaki gibidir.

1- Lâm-lâmel arası muayene: Hareket muayenesi yapılacak mikroorganizmanın önce, uygun koşullarda (ısı, süre, besi yeri, v.s.) sıvı bir besi yerinde taze saf kültürünün (18-24 saatlik) yapılması gereklidir. Böyle kültürden bir öze dolusu alınarak, temiz, yağsız ve pürüzsüz bir lâm üzerine konur (lâm soğuksa, hafifçe ısıtılarak oda sıcaklığı derecesine yükseltilir). Etüvden hareket muayenesi için çıkarılan kültürden hemen preparat yapılması ve kültürün soğumaması, hareketi iyi görebilme bakımından yararlıdır. Üzerine, aynı şekilde, temiz bir lâmel kapatılarak hazırlanan preparat ya karanlık saha veya normal ışık mikroskobunda muayene edilir. Işık mikroskobu kullanırken mikroskobun eğilmemesi, diyaframının yeterince kısılarak iyi bir kontrast sağlanması iyi bir görünüm sağlar. Mikroskop düz bir zemin üzerine yerleştirilmiş olmalı ve sıvı akışı olmamalıdır.

Lüzumu halinde, katı besi yerlerinde üremiş kolonilerden de hareket muayenesi yapılabilir. Bunun için, temiz bir lâm üzerine bir damla steril fizyolojik su konulur ve agardan alınan bir-iki koloni, sıvı içinde suspansiyon yapılır. Üzerine lâmel kapatılarak aynı yukarıdaki gibi muayene edilir.

Eğer mikropların hareketi iyice görülüyorsa, diğer bir deyimle, mikroskop sahasında mikroplar yavaş veya hızlı olarak yer değiştiriyorlarsa, kültür veya mikroorganizma hareketli olarak kabul edilir. Ancak, saf olarak hazırlanan kültürün sonradan kontamine olup olmadığının da bilinmesine gerek vardır. Bu amaçla, froti hazırlanarak Gramla boyama uygulanır ve durum incelenir. Kültürde hareket gözlenememişse, kesin karar vermeden önce, kültürü tekrar etüve koyarak ve iyice karıştırarak tekrar ayrı bir teknikle hareket muayenesi uygulanır. Bu ikinci muayenede hareket görülmese, bu takdirde, mikroorganizma hareketsiz kabul edilir. Şüpheli bir durum görülüyorsa, bu mikrobun katı besi yerlerindeki kolonilerden bir tane alınarak tekrar saf olarak ve uygun koşullarda üretilir ve tekrar bir hareket muayenesine tabi tutulabilir.

Hareket muayenesi yaparken dikkat edilecek bazı noktalar da şunlar olmalıdır: I- Mikroskobun düz ve sağlam bir masa üzerine konması, 2- Lâm üzerinde iyi bir (homojen) suspansiyon yapılması, 3- Kültürün iyice karıştırılması, 4- Etüvden çıkarılınca aradan zaman geçmeden veya kültür soğumadan hemen preparat hazırlanması, 5- Lâmın soğuk olmaması, 6- Soluk havasının muayene sıvısına kadar ulaşıp sıvıda bir kayma yapmaması, 7- Lâm üzerindeki kültür sıvısında bir akma hareketi varsa, bu duruncaya kadar, gözlem yapılmaması, 8- Masa üzerine elle fazla bastırarak muayene sıvısında akıntı yapılmaması ve 9- Laboratuvar sıcaklığının (veya muayene ortamının) normal olması (22-25 °C) gereklidir.

2- Asılı damla yöntemi: Bu teknikle muayene yapabilmek için özel lâmlara (ortası çukur veya üzerinde metal veya plastik silindirik halka bulunan lâmlar) ihtiyaç vardır. Taze sıvı kültürden bir öze dolusu alınarak, temiz bir lâmel üzerine konur. Bu lâmel tersine döndürülerek lâmın çukur kısmı veya silindir halkanın üzerine kapatılır. Damla boşlukla sarkar bir duruma getirilir. Lâmelin kenarları sıvı parafin veya oje ile kapatılır. Bilinen tarzda muayene edilir.

Katı besi yerinde üremiş mikroplardan da hareket muayenesi yapılabilir. Gerek lâm-lâmel arası ve gerekse asılı damla teknikleri ile hareket muayeneleri yaparken, 40 x veya 60 x objektifler kullanılır. Eğer immersiyon sistemi icap ederse sedir yağı kullanmak gereklidir.

3- Yarı-katı besi yerinde muayene: Yarı katı ortamlarda hareket muayenesi biraz zaman alıcı ve sonucun da tam kesin okunamaması gibi sakıncaları nedeniyle, önceki yöntemlerden daha az tercih edilir. Hareket muayenesi istenen mikroorganizmanın tek koloniden oluşan taze ve saf sıvı kültürü hazırlanır. Bu kültüre daldırılan steril iğne, 10 cc. yüksekliğindeki berrak yarı katı ortama (% 0.4-0.5 agarlı) dibe kadar daldırılır ve çıkarılır. Bundan sonra, besi yeri (24 veya 48 saat) 37 °C 'de inkubasyona konur ve sonuç gözle değerlendirilir. Eğer, besi yerinin yüzeyinde ve inokulasyon hattı boyunca üreme var, sağa veya sola doğru bir dallanma ve yayılma yoksa, mikroorganizma hareketsizdir. Eğer, inokulasyon hattından etrafa agarın içine doğru bir yayılma ve dallanma gözlenirse mikrop, hareketli kabul edilir.

4- Flagella boyaması: Hastalık etkenlerinin identifikasyonunda, mikropların flagellalı olup olmadıklarını anlamada, boyama yöntemi çok az kullanılır. Bu amaçla, Kodaka veya Leifson boyama tekniğinden yararlanılabilir.

5- Mikroorganizmalardaki flagellayı göstermek için elektron mikroskop muayeneleri genellikle uygulanmaz. Ancak, özel çalışmalar için bu araçtan yararlanılabilir.

03. Boyama İçin Preparat Hazırlanması

Boyamak amacı ile, şüpheli kültürlerden veya marazi maddelerden (organlardan, patolojik sıvılardan, kandan, idrar, gaita, sperma, süt, vs) preparatlar hazırlanır, genel ve/veya özel boyama teknikleriyle boyanarak mikroskopla muayene edilirler.

Otopsiden veya biopsiden elde edilen 1-2 mm3 miktarlarındaki küçük parçacıklar temiz ve kullanılmamış iki lâm arasında ezilerek, veya pensle tutulan organ parçası lâma sürülerek veya lâm organ parçasının kesit yüzüne sürülerek ince bir preparat hazırlanır. Organın veya parçanın yüzeyinde kontaminasyon olasılığı varsa, bu takdirde, kızdırılan bir spatül organın yüzeyine kısa bir sürede tutularak (değdirilerek) organın yüzeyi steril hale getirilir. Bundan sonra, bu bölgeden içeri sokulan pens veya öze ile alınan küçük parçalar hem froti yapmak ve hem de ekim için kullanılır.

Patolojik sıvılardan ve sıvı kültürlerden preparat hazırlamada öze kullanılır. Bu sıvılardan alınan bir öze dolusu materyal lâmın tam ortasına konarak ince bir tabaka halinde ve yavaşça (etrafa sıçratmadan) yayılır. Eküvyonun marazi madde içeren ucu, lâma sürülerek froti hazırlanır. Kandan preparat hazırlamada, temiz bir lâmın uçlarından birine yakın yere bir damla taze kan konur ve diğer bir lâmın kısa kenarı veya lâmel ile ileri itilmek suretiyle ince bir preparat hazırlanır. Kanı yaymada kullanılan lâm veya lâmel, kan ihtiva eden lâm ile 45 derecelik açı yapacak şekilde eğik tutulur. Hazırlanan kan frotisinin ince ve homojen olması gereklidir.

Preparatlar amaca ve usulüne göre hazırlandıktan sonra yapılacak ikinci işlem, bunların kurutulmasıdır. Preparatların genellikle, havagazı alevinin üstünde ve döndürülerek (dairesel ve yatay) çabuk kurumaları sağlanır. Lâm, alevin üstünde ve yanmayacak bir yükseklikte pensle veya parmaklarla tutularak kurutulur. Kurutma işlemi, ayrıca, preparatlar oda veya etüv ısısında bırakılmak suretiyle de yapılabilir. Kurutma işlemi sırasında, lâm üzerinde bulunan mikroplar hafifce lâma yapışırlar. Ancak, su ile yıkandıklarında düşebilirler.

Preparatlar kurutulduktan sonra tespit edilirler. Bunun birçok yararları bulunmaktadır. 1- Mikroorganizmalar, genellikle, ölürler, 2- Mikroplar lâma yapışırlar, 3- Mikropların protoplasmaları koagule olur ve 4- Sütrüktürleri muhafaza edilir. Ancak, fazla ısıda mikropların şekillerinde bozukluklar gözlenebilir.

Tespit başlıca iki tarzda yapılır. 1- Fiziksel (termal) tespit: Kurutulan preparat, bir ucundan özel pensle tutularak alevin içinden 3 defa geçirilerek tespit edilir. Tespit sırasında preparatın yanmamasına dikkat edilir. Yanmış preparatlarda mikroorganizmalar dağılmış, şişmiş ve deforme olmuş bir şekilde görülürler. 2- Kimyasal tespit: Kan ve dokulardan yapılan preparatlar kimyasal maddeler (metil alkol, alkol-eter, alkol-aseton, etil alkol, vs.) yardımı ile tespit edilirler. Metil alkol ile 3-4 veya etil alkol de 10 dakika süre ile tespit yapıldıktan sonra fiksatifler dökülür ve preparat çok hafif akan suda yıkanır.

Böylece preparatlar boyanmak için hazır hale gelmiştir. Amaca göre basit, kompleks veya özel boyama yöntemleri kullanılır.

1 Kaynak: Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 10616 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader