Mikroskoplar

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1

01. Genel Bilgiler

Mikroorganizmalar gözle görülemeyecek kadar küçük varlıklardır. İnsan gözü 200-250 mikrometreden yukarı olan büyüklükteki objeleri görebilir. Bu limitlerin altındakileri görülemez Mikroorganizmaların boyutları ise, 0,1-10 nm arasında değişir. Bu nedenle, mikropları görmede ve bunlar hakkında bilgi edinmede özel ve büyütücü aletler kullanma zorunluluğu vardır.

Kullanılan ilk büyüteçlerin, büyütme kapasiteleri 10 x ile 20 x arasında olduğu bilinmektedir. Hollandalı bir gözlükçü olan, Zaccharias Janssen (1590), ikinci bir mercek kullanarak objeleri 50 x veya 100 x büyütebilmeyi başarmıştır. Galileo (1610), daha gelişmiş bir alet (mikroskop) yapmıştır. Kepler (1611), iki mercek yardımıyla çalışan ve Robert Hooke ( 1635-1703) 200 x büyütebilen mikroskobu yapmışlardır. Antonj van Leeuwenhoek (1632-1723), yaptığı ve 300 x dan daha fazla büyütebilen mikroskobu ile tükürük, biber infüsyonu, mantar, yaprak, vs. maddeleri inceleyerek, bunlarda bulunan mikropları görmüş şekil ve hareketlerini çizmiştir.

Bu tarihlerden sonra mikroskoplar daha da geliştirilmiş bu büyütme kapasiteleri artırılmıştır. iki mercekli oküler Huygens (1684) ve akromatik objektif ve kondansatör de Abbe (1840-1905) tarafından yapılmış ve pratiğe konulmuştur.

Günümüzde çeşitli amaçlar için yapılan mikroskoplar başlıca 5 temel bölüme ayrılırlar. 1- Işık mikroskopları, 2- Karanlık saha mikroskopları, 3- Fluoresens mikroskopları, 4- Faz-kontrast mikroskobu, 5- Elektron mikroskopları.

02. Işık Mikroskobu

Laboratuvarlarda genel amaçlar için her zaman kullanılan ve büyütme kapasitesi 1000-3000 arası olan mikroskoplardır. Bu tür mikroskoplar başlıca 3 kısımdan oluşmaktadır. 1- Optik kısmı, 2- Aydınlatma kısmı, 3- Mekanik kısım.

02.01. Optik Kısım

Optik kısım, mikroskobun objeleri büyüten en önemli bir bölümü olup objektif ve okülerden teşekkül eder.

a) Objektifler: Çeşitli büyütme kapasitelerine sahip olan objektifler birçok mercekten meydana gelmiş olup kapalı bir madeni sistem içinde bulunurlar. Objektifler büyütme amacına göre 4 veya 5 adet olabilirler. Optik kısmın objeye en yakın bölümünü oluşturan objektifler, mikroskop tüpünün altına yerleştirilmiş ve orta eksen etrafında dönebilen bir tablaya (rovelver) vidalanmışlardır. Üzerlerinde büyütme oranlarını bildiren, I0 x, 20 x, 40 x, 90 x, veya 100 x gibi rakamlar ile her objektifin numerik açıklığını (NA) ifade eden 0.30, 0.75, 1.00 ve 1.25 gibi sayılar bulunur. Objektifler, akromatik, fluorit, semiapokromatik ve apokromatik olmak üzere başlıca 4 türdür. Bu ayrım, bünyelerinde bulunan merceklerin yapılış ve diziliş özelliğine göre yapılmıştır. Çünkü, bir objektif 4-8 adet çeşitli tipteki merceklerin kombinasyonundan oluşmaktadır. En basit ve ucuz olan akromatik türde olan objektiftir ve bu genel amaçlar içinde yeterli görev yapar. Apokromatikler, çok önemli veya kritik çalışmalar için tercih edilirler.

Objektiflerin amaçları, 1- Objenin herhangi bir yerinden gelen ışınları birleştirmek, 2- Bu ışınları odak noktasında toplamak ve 3- Odak noktasında oluşan imajı büyütmektir. Mikroskobun büyütmesi, objektifler üzerindeki numaralar (10 X, 20 x, v.s....) ile oküler üzerindeki sayıların (5 x, 7 x ,10 X ,....) çarpımına eşittir. Eğer objektif 100 X ve oküler 10 x ise objenin büyümesi 100 x 10 = 1000’dir.

b) Okülerler: Optik kısmın gözle bakılan ve tüpün üst kısmına konulan parçasını oluşturur. Okülerde de, büyütmelerine göre numaralar (5 x, 7 x, 10 x, 15 x, 20 x, 25 x ) bulunur. Okülerlerin görevi objektif tarafından oluşturulan obje imajını büyütmek ve objektifin bazı hatalarını düzeltmektir. Bu amaçları kapsamak üzere çeşitli türde (huygenian, hiperplane ve düzeltici oküler) okülerler imal edilmiştir. Okülerler genellikle 2 ve bazen 3 mercekten oluşurlar.

Bazı mikroskoplarda tek gözle bakmaya yarayan bir oküler (monoküler) bulunmasına karşın, araştırma mikroskoplarda genellikle iki gözle bakmaya yarayan çift oküler (binoküler) bulunur. Bu sonuncu sistemde, objektifken geçen ışınlar prizmalar yardımıyla 2 göze taksim edilirler. Binoküler sistem başlık, sağa sola dönmesi ve eğik olması nedeniyle de, monoküler sisteme oranla, daha rahat ve kolay bir bakış sağlar.

Bazı binoküler başlıklarda, fotoğraf makinesi yerleştirmek için üçüncü bir tüp daha bulunur. Ancak, monoküler sisteme uyabilen mikrofoto başlıkları da vardır. Bazılarında da aynı anda iki kişinin bakabileceği tertibatlar bulunmaktadır.

Büyütme: Bir mikroskobun büyütmesi, I- Objektifin fokal uzunluğu, 2- Okülerin büyütme kudreti ve 3- Optikal tüp uzunluğuna bağlıdır. Objektifin büyütmesi şu şekilde hesap edilebilir:

Objektifin büyütmesi = (tüp uzunluğu) / (objektifin fokal uzunluğu)

Objektifin fokal uzunluğu 16 mm ve mekanik tüp uzunluğu 160 mm ise, objektifin büyütmesi = (160) / (16) = 10 olur. Objektifin fokal uzunluğu 4 ise, 160 /4 = 40 'dır. Objektifin fokal uzunluğu 2 ise, 160/2 = 80 'dir. Okülerin büyütmesi, genellikle üzerinde yazılmıştır (5x, 7x, l0x, 12x, 15x, 20x).

Mikroskobun toplam büyütmesi = (Tüp uzunluğu) x (oküler büyütmesi) / (objektifin fokal uzunluğu) veya = objektif büyütmesi x oküler büyütmesidir .

Numerikal apertür (NA): Bir mikroskobun numerikal apertürü, bunun resolusyon kuvvetinin bir ölçüsünü ifade eder. Bu açıklık ne kadar fazla olursa resolusyon kudreti de (birbirine çok yakın iki noktayı ayırma kabiliyeti) o kadar fazla olur ve obje ince ayrıntısına kadar görülebilir. Numerikal apertür bir merceğin çapının kendi odak uzaklığına olan oranı olarak ta tanımlanabilir ve aşağıdaki matematiksel formülle ifade edilir.

NA = n.Sin U

Bu formülde, n: obje ile objektif arasındaki ortamın kırma (refraksiyon) indeksi; U: objenin orta noktasından çıkarak göze kadar gelen ekstrem ışınların arasındaki açının yarısıdır. NA, büyüdükçe birbirine çok yakın iki cismi ayırma kabiliyeti de artar.

Bir objektifin kalitesi, oluşan imajın parlaklığı ile resolusyon ve NA ile ilişkilidir. Numerikal apertürü büyük olan (1.0-1.2-1.3) objektifler sedir yağı ile birlikte kullanılır ve bu nedenle de immersiyon objektifi (90 x ve 100 x) diye de adlandırılırlar. İmmersiyon objektifi ile çalışmada obje ile objektif arasına sedir yağı konur. Sedir yağının kırma (refraksiyon) indeksi (1.535), lâmınki ile yakın değerde olduğundan, kondansatörden gelerek lâmdan geçen ışınlar tekrar kırılmadan sedir yağından düz olarak geçerek objektifken içeri girerler. Eğer sedir yağı kullanılmazsa, obje ile objektif arasında hava bulunacaktır ki bunun kırma indeksi 1.00 olduğundan lâmdan geçen ışık, objektife girmeden tekrar yanlara doğru kırılacak ve objektife az ışık girecektir. Bu da iyi ve net bir görüntü sağlamaz. Sedir yağı kullanılınca çok daha aydınlık bir saha elde edilir. Sedir yağı gibi kullanılabilecek diğer sıvılar arasında, balsam 1.524, euparal 1.483, gliserol 1.460, su 1.334 vardır.

Resolusyon: Bu terim, birbirine çok yakın olan iki cismin bir mercek tarafından ayırt edilebilme kabiliyetini ifade eder. Resolusyon aynı zamanda, ışığın dalga uzunluğu ve NA ile de ilişkilidir. Işığın dalga uzunluğu ne kadar kısa ise objektif daha ayrıntılı ve net görüntü verir. Bu nedenle, dalga uzunluğu daha küçük olan UV ışınları (görülebilen ışınların yarısı kadar) ile daha büyük NA = 2.5 elde edilebilir. Elektron mikroskopta kullanılan elektronların dalga uzunluğu, görülebilen ışınların I /100.000 olduğundan bu mikroskopla, ışık mikroskobunun 250 katı NA elde edilebilir.

02.02. Aydınlatma kısmı

Aydınlatma bölümü, lâm üzerine konan objeyi aydınlatmak için ışık kaynağı, bu ışığı obje üzerine doğru yansıtan veya yönelten ayna ve ışığı obje üzerinde toplayan kondansatörden oluşur.
a) Işık kaynağı: Mikroskoplarda objeyi aydınlatmak için, genellikle elektrikle çalışan, mikroskobun dışında bulunan veya mikroskobun içine monte edilen ışık kaynakları kullanılmaktadır. Bu ışık kaynakları yeterince ışık verirler ve bazıları da ışığı ayarlamak için de özel diyaframlara sahiptirler. Işık kaynağının bulunmadığı durumlarda güneş ışığından da yararlanılır.
b) Ayna: Mikroskop üzerine monte edilmiş bir yüzü konkav ve diğer yüzü düz olan aynalar, ışık kaynağından gelen ışınları kondansatöre ve dolayısıyla obje üzerine yansıtırlar. Konkav yüz daha fazla ışın topladığından immersiyon objektifleriyle çalışmalarda bu yüz kullanılır. Bazı araştırma mikroskoplarında ışık kaynağı tam kondansatörün altına monte edilmiştir. Bazılarında da ayna, mikroskop içinde bulunur.
c) Filtre: Kondansatörün altında bulunan özel ve halka şeklindeki yere ışık kaynağından gelen ışınları süzen, mavi, yeşil veya mat filtreler konarak iyi görüntü sağlanmaya çalışılır.
d) Diyafram: Lâmbadan gelen ışığın, gereğine göre az veya fazla oranda kondansatöre girmesini sağlamak için kondansatörün altında diyafram bulunur. İmmersiyonla çalışmalarda genellikle diyafram tam açılarak içeri fazla ışık girmesi ve objenin aydınlatılması sağlanır. Buna karşılık, hareket muayenelerinde ise iyi bir kontrast sağlanması için, diyaframa gereği kadar kapatılır.
e) Kondansatör: Bir mikroskopta kondansatörün esas görevi ışığı obje üzerinde toplamak ve yeterince aydınlatmaktır. Genellikle iki mercekten oluşan kondansatörler, bir düğme ile aşağı yukarı iner çıkar ve ışığın iyi fokus olmasını sağlarlar. Akromatik türdeki kondansatörlerde 5-6 tane mercek bulunur.

02.03. Mekanik kısım

Mikroskopta mekanik kısım oküler ve objektifleri taşıyan tüp (bazı mikroskoplarda bu tüp kısmı çok daha kısa bir şekilde bulunur), mikroskobu tutmaya yarayan kol, preparatı koymak için tabla ve mikroskobun sağlamca oturmasını sağlayan ağır bir ayak (taban) oluşturur. Ancak, bu sayılan kısımlar mikroskop türlerine göre az çok değişiklik gösterirler.

Mikroskop tüpü, bir makrometre ile yukarı ve aşağı inip çıkabilir bir yapıya sahiptir. Genellikle iç içe geçebilen iki tüpten oluşur. Üst ucunda oküler ve alt ucunda da rovelver ve buna takılmış objektifler bulunur. Mikroskop tüplerinin toplam uzunluğu genellikle 160 mm. kadardır.

Mikroskopları tutmaya ve kaldırmaya yarayan kol yarım ay veya düz bir şekilde olabilir. Bunun üst ucu tüpün gövdesine alt ucu da mikroskop tablasına bağlanmıştır. Kol ile ayak kısmını birleştiren eklemden mikroskop eğilebilir. Aynı zamanda makro ve mikrometre düğmeleri de kol üzerinde bulunurlar.

Mikroskop tablası yuvarlak veya dört köşe olup üzerine obje konur. Bazılarında tabla, yanlardaki düğmeler tarafından hareket ettirilmesine karşın bir kısmında da sabit olup, objeyi hareket ettirmek için özel sürgü (şaryo) tertibatı bulunur. Bazı mikroskoplarda tabla sabittir, bir kısmında da aşağı yukarı inip çıkabilir (mikrofotolu mikroskoplarda, bazı binokuler mikroskoplarda, vs).

Mikroskop at nalı, oval veya düz ağır bir ayakla (taban) sağlam olarak masa üzerine konulur. Bazı mikroskoplarda ayak içinde aydınlatma ve ayna tertibatı bulunur.

02.04. Mikroskobun Bakımı ve Kullanılması

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında, mikroskoplar en fazla kullanılan malzemenin başında gelen ve bakımının titizlikle yapılması zorunlu olan bir laboratuvar aracıdır. Mikroskopların uzun ömürlü ve devamlı kullanılabilir bir durumda olabilmesi, bunların bakım ve iyi idare edilmesine bağlıdır. Bunun için:

1- Muayeneye başlamadan önce, mikroskobun optik parçalarının sağlam, tozsuz ve lekesiz olduğuna dikkat edilir. Optik kısım üzerindeki toz ve lekeler mercek kâğıtları veya ince tülbentle silinerek giderilir. Objektif ve kondansatörün üst merceği üzerinde kurumuş sedir yağı lekesi, ksilola batırılmış tülbentle silinir ve hemen kuru tülbentle veya mercek kâğıdı ile de kurulanır.
2- Lâm üzerinde hazırlanan preparatın alt kısmı mikroskobun tablasının ortasındaki boşluğa gelmek üzere yerleştirilir veya preparat tam bu boşluğa gelecek tarzda ayarlanır.
3- Tabla üzerinde bulunan maşalarla veya özel sürgü tertibatının kolları arasına preparat yerleştirilerek tespit edilir.
4- Kondansatör yukarı kaldırılır ve diyaframı tam açılır.
5- Eğer varsa, aynanın konkav yüzü ışığa çevrilerek bol miktarda ışığın kondansatöre girmesi sağlanır. Işığın durumu okülerden bakılarak kontrol edilir.
6- Preparat üzerine çok küçük bir damla sedir yağı konur.
7- İmmersiyon objektiflerinden biri (90 x veya 100 x ) tüpün tam altına getirilir ve yerine yerleştirilir.
8- İmmersiyon objektifi, yandan bakılmak suretiyle ve makrometre yardımıyla sedir yağının içine (lâma değecek kadar, fakat lâma değdirmemeli) daldırılır. Bazı mikroskoplarda tabla yukarı kaldırılmak suretiyle aynı işlem yapılır.
9- Okülerden bakılarak ışık ayarı tekrar gözden geçirilir ve yine okülerden bakılarak makrometre ile mikroskobun tüpü çok hafifçe yukarı kaldırılır (veya tabla aşağı indirilir) ve mikroskop alanı bulunur.
10- Mikrometre ile de netlik ayarı yapılır. Mikroskop sahası üzeri vidalarla tablanın sağa-sola veya yukarı-aşağı olan hareketiyle veya özel tertibatla değiştirilerek, preparatın çeşitli yerleri aranır.
11- Monoküler mikroskoplarda genellikle sol gözle bakılır ve sağ göz açık tutulur, kapatılmaz.
12- Okülerden bakarken mikroskop tüpü hiç bir zaman aşağı indirilmez veya tabla yukarı kaldırılmaz. Objektif, lâm ve kondansatörün üst merceği kırılabilir.
13- İmmersiyon objektifi ile çalışırken daima sedir yağı kullanılmalıdır. Sedir yağı bazı durumlarda mikrop ihtiva edebilir. Buna çok dikkat etmeli ve sedir yağını bu yönden kontrolden geçirmelidir.
14- Hareket muayenesi yapılırken iyi bir kontras temini için diyaframa gereği kadar kapatılır. Bazı durumlarda kondansatör de hafifçe aşağı indirilebilir. Hareket muayenelerinde mikroskobun düz bir zemin üzerine yerleştirilmesi, muayene edilecek sıvı kültürde bir akıntının oluşmaması bakımından önemlidir. Mikroskop hiç bir zaman eğilmez.
15- Çalışma bittikten sonra lâm özel antiseptik solusyon içine bırakılır.
16- Mikroskop temizlenir ve objektifteki sedir yağı da iyice giderilir. İcap ediyorsa ksilol kullanılır.
17- Mikroskoplar özel kutularına konmadan önce, küçük büyütmeli objektif tüpün altına yerleştirilir ve sonra kutuya konurlar.
18- Mikroskopların merceklerine elle dokunulmaz.
19- Makro-ve mikrometreler daima çok yavaş döndürülür.
20- Mikroskobun herhangi bir parçası diğer mikroskobunki ile değiştirilmez.

02.05. Bakterilerin Ölçülmesi

Mikroorganizmaların boyutlarını ölçmede, biri oküler mikrometre ve diğeri de stage (objektif) mikrometre olmak üzere belli aralıklarla çizgilere sahip olan iki tane özel ölçek kullanılır. Mikropların boylarını ölçmede aşağıdaki gibi hareket edilir:
1- Disk şeklinde olan oküler mikrometre, oküler sisteme yerleştirilir.
2- Stage mikrometre de, mikroskobun tablası üzerine konur ve maşalarla sabitleştirilir. Küçük büyütmeli objektifle bakılarak, ölçekli kısmın tam görünmesi sağlanır.
3- Sonra immersiyon objektifi tüpün altına yerleştirilir.
4- Oküler mikrometrede bulunan ölçeklerle stage mikrometre ölçeklerinin üst üste gelmesi sağlanır.
5- Stage mikrometrede bulunan iki çizgi arası 10 mikrometre (0,01 mm.) kadardır. İki çizgi arasına tam isabet eden oküler mikrometre çizgileri hesap edilir ve kaydedilir. Böylece, oküler mikrometre çizgilerinin aralıkları da hesap edilmiş olur.
6- Bundan sonra, stage mikrometre çıkarılarak yerine boyalı preparat konur.
7- Preparattaki mikroorganizmaların boyları veya çapı oküler mikrometre çizgileri yardımıyla ölçülür.
Örn, stage mikrometrenin her 10 mikrometrelik aralığına 5 tane oküler mikrometre çizgisi isabet etmişse, bu takdirde oküler mikrometrenin iki küçük çizgi arası 2 mikrometre olmuş olur. Mikrobun boyu kaç aralığa kadar uzanmışsa buna göre karar verilir.

03. Karanlık Saha Mikroskobu

Bu mikroskop, özellikle, spiroketaları görmede ve hareket muayeneleri yapmakta kullanılmaktadır. Özel kondansatörler (abbe, parabolit veya kardioid kondansatörler) yardımıyla sağlanan karanlık sahada, alttan gelen ışık, kondansatörün ortasındaki siyah ışık geçirmeyen bir bölge nedeniyle yanlarından girerek preparat üzerine gelir. Bu sistemde ışık tüp (veya objektif) içine girmez yanlara dağılım gösterir. Ancak, karanlık alanda bulunan mikroorganizma, v.s. nin yansıttığı ışık, muayene eden şahsın gözüne ulaşır. Bunun sonunda mikroorganizmalar parlak, saha ise karanlık görülür.

Karanlık alan oluşturmak için yapılmış kondansatörler, normal ışık mikroskobuna monte edilerek kullanılırlar. En çok kullanılan karanlık alan kondansatörü abbe tipidir. Parabolit tipi kondansatör immersiyon sistemi ile birlikte kullanılır. Yani kondansatörle lâm arasına sedir yağı veya gliserin konur.

Karanlık saha muayenelerinde kullanılan immersiyon objektifinin NA.’sı 1.0’den küçük ve ışık kaynağının da kuvvetli olması iyi bir görünüm için gereklidir. Ancak, kuru sistem objektiflerle de (NA: 0.3-0.65) çok iyi görünümler elde edilebilir.

Karanlık saha muayeneleri için aşağıdaki tarzda preparat hazırlanmalıdır :
1- Kullanılacak lâm, ince, pürüzsüz ve yağsız olmalıdır. Kalınlığı I.0-1-1 mm. yi geçmemeli ve bu kalınlık genellikle yeterlidir.
2- Lâm üzerinde hazırlanan preparat çok kalın ve çok kesif olmamalıdır. Kalın preparatlar karanlık alanda kontrası azaltır.
3- Muayene olacak obje kondansatörün fokusu üzerinde bulunmalıdır. Eğer, lâm çok kalın ise, kondansatörün fokusu preparatın altında olmalı, lâm çok ince ise bu takdirde lâm ile kondansatör arasına sedir yağı konarak kontak sağlanmalıdır.
4- İyi bir görünüm için, eğer gerekiyorsa, kondansatör hafifçe aşağı veya yukarı indirilip kaldırılabilir.

04. Faz-Kontrast Mikroskobu

Bu tür mikroskoplarla canlı mikrop, hücre, v.s. içindeki çeşitli organizasyonları, oluşturdukları ayrı kontraslarından yararlanarak tanımlamak mümkün olabilmektedir. Bu nedenle de faz-kontrast mikroskoplar genel biyolojik amaçlar için çok fazla kullanılmaktadır.

Normal ışık mikroskopları da bazı değişikliklerle faz-kontrast haline getirilebilir. Bunun için:
1- Özel kondansatör: Bu kondansatörde halka şeklinde diyafram dizileri ihtiva eden dönen metal disk bulunur. Bu diyaframlar, objektiflerin NA’sına göre birlikte kullanılır.
2- Özel faz objektifleri: Normal objektiflerin arka fokal düzlemine bir faz difraksiyon levhası konarak elde edilir. Bunlar cam levhalardan oluşmuşlardır ve ışığın dalga boyunu I /4'ü kadar değiştirirler.
3- Oküler: Normal oküler kullanılır.

Faz mikroskobu ile, boyanmamış bir objeye (hücre, bakteri, v.s.) bakıldığı zaman, biri objektifin arkasındaki fokal düzlemde, diğeri objeden çeşitli açılarla kırılarak yansıyan ışınların oluşturduğu görüntü olmak üzere iki obje hayali meydana gelir. Böylece hücrelerin iç yapısını daha ayrıntılı görmek mümkün olmaktadır.

05. Fluoresens Mikroskobu

Bazı maddeler (uranyum cevheri, uranyum camı, yağ damlacıkları, aesculin solusyonu, kinin sülfat, çeşitli boyalar, v.s.) ultraviole ışınlarına maruz bırakılırsa ışıklı hale gelirler. Eğer, dokular hücre veya bakterilerle fluoresens boyalarla boyanırlarsa ve UV-ışınları altında mikroskopta incelenirse, ışık saçan parlak cisimcikler halinde görülürler. Bu amaçla kullanılan boyalar; auramin O, acridin orange R, berberin sulfat, primulin, thioflavin S, trypaflavin, thiazo-sarısı G, corifosfin O, fluorescein, rheonine A, rhodamine B, morin, v.s.dir.

UV-ışınları ile çalışırken gözü korumak için özel opak filtreler kullanılır. Diğer bir filtre sistemi de UV-ışınları veren kaynağın (genellikle cıva lâmbası) önüne konur. Bu filtreler sadece UV-ışınlarını geçirir.

Bazı mikropların (M. tuberculosis gibi) fluorokrom maddelere karşı özel affinitesi vardır. Bu boya etkenin etrafındaki balmumu benzeri madde ile kolayca birleşir. Bu nedenle de çabuk teşhiste işe yarar.

UV-mikroskobu olarak normal ışık mikroskobundan yararlanılabilir. Muayene için karanlık oda tercih edilir. Preparat üzerine herhangi bir sıvı madde (sedir yağı gibi) konmaz. Çünkü, bu fluoresans verebilir. Görüntü, normal ışık mikroskobundan daha büyük olur.

İmmun fluoresens: Bu teknikte serumun gama globulinlerindeki antikorlar özel boyalarla (fluorescein isothiocyanate ve lissamine rhodane B (RB1200) boyanır ve sonra preparat üzerine konur. Antijen antikor birleşmesinden yararlanılarak, antijenle birleşen boyalı antikor, UV-ışınları altında parıltılar gösterir ve bilinmeyen mikroorganizma teşhis edilir.

06. Elektron Mikroskop

Elektron mikroskoplar, mikrobiyolojik alanda çok kullanılan ve geliştirilmiş bir mikroskop türleridir. Ancak yapısının komplike olması, preparatın hazırlanması ve mikroskobun kullanılması gibi özel güçlükler yanı sıra çok pahalıdırlar da. Elektron mikroskopla her türlü mikroorganizmayı ve hücreyi incelemek ve ince yapısı hakkında bilgi edinmek mümkündür.

Bu mikroskopta kullanılan elektronların dalga uzunluğu, normal ışığınkinden 100.000 defa daha kısa olması, resolusyonun ve büyütmenin çok fazla olmasına temel teşkil eder. Resolusyon kudretinin ışık mikroskobundan 100-250 defa daha büyük olması büyütmeyi 60.000-100.000’e çıkarır. Özel ilave büyüteçle 250.000-500.000 büyütebilecek duruma getirilebilir.

Işık mikroskobunda 200-250 nm boyutlarında olanlar, ultraviolet mikroskobu ile de 75-100 nm büyüklüktekiler ve elektron mikroskopta ise bunlardan çok daha küçük olanlar (5-10 nm) görülebilirler.

Elektron mikroskop ile ışık mikroskopları arasındaki temel farklar, bunda ışık kaynağı yerine dalga boyu çok kısa olan elektronlar ve cam mercekler yerine de elektromanyetik kondansatörlerin kullanılmasıdır. Elektron mikroskobun önemli kısımları şöyledir: Tungusten tel flamentinden oluşan ve elektron verebilen bir kaynak ve bunun altında katot levhası bulunur. Katottan yüksek bir hızla çıkan elektron demeti, elektromanyetik kondansatörler arasından geçer. Kondansatörler yayılan elektronları toplar ve görüntüyü büyütür. Böyle objenin hayali, her kondansatör tarafından büyütülür. Son kondansatörde 300-500 defa büyütülerek imaj mikroskobun alt kısmında ve eğik olarak yerleştirilmiş fluoresent ekran üzerine yansır ve obje görülür. Ayrıca, dışarıda bulunan özel büyüteç (binokular) ile de objenin görüntüsü fazlaca büyütülebilir. Obje göründükten sonra uygun bir saha bulabilmek için mikroskobun dışındaki özel düğme veya kollarla alan değiştirilebilir. Resim çekmek için özel tertibatı vardır.

Preparatın hazırlanması için şöyle hareket edilir (AEG Elektron mikroskobu için):
1- Formvar solusyonu bir beherglasa konur ve bunun içine de temiz lâmlar daldırılır ve çıkarılır.
2- Çok az bir süre havada kurutulduktan sonra lâm üzerinde oluşan ince tabaka dikdörtgen şeklinde çizilir.
3- Petri kutusunda bulunan bidistile suya, lâmlar suyun yüzeyi ile 45oC. lik açı yapacak şeklinde daldırılır ve ince tabaka su üzerine geçer.
4- Temiz gritlerin mat yüzü su üzerindeki ince tabakanın üzerine gelecek şekilde yerleştirilir. Böylece 10-15 grit konabilir.
5- Gritli film üzerine kurutma kağıdı konarak sudan çıkarılır. Gritlerin film ihtiva eden yüzleri üstte ve parlak yüzü de kurutma kağıdı üzerinde kalır.
6- Kurutmak için 30-45 dakika 37 oC ’de bırakılır.
7- İnce pensle tutulan gritler özel kutulara konur.
8- Hazırlanan gritler üzerine 30-40 mikrometre kalınlıkta fikze edilmiş kesitler veya mikrobiyolojik materyaller konur. Gerekirse boyanırlar.
9- Gritler mikroskop üzerindeki özel yerlerine yerleştirilirler. Bozulan vakum tekrar sağlanır.
10- Yüksek voltaj verilir ve preparatın gölgesi, alttaki ekranda görülür. Sonra makro-ve mikrometrelerle netlik yapılır.
Son yıllarda çeşitli amaçlara uygun, değişik ve daha kuvvetli elektron mikroskoplar yapılmış (Transmission electron microcope, TEM; Scanning electron microscope, SEM; ve diğerleri) ve pratiğe konulmuştur.

Bütün mikroskopların şekil ve yapılarında çok köklü değişiklikler yapılarak daha iyi, net ve ayrıntılı görüntüler elde edilmiştir.

 1 Kaynak: Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 18355 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader