Boyalar ve Boyama Metotları

Boyalar ve Boyama Metotları 

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1

01. Genel Bilgiler

Bakterinin yapısı, içinde üredikleri ortamdan, çok az bir refraktif indeksle ayrıldığından, laboratuvarlarda genel amaçlar için kullanılan ışık mikroskoplarıyla iyi görülmeleri zordur. Bu semitransperent yapı, ancak boyanarak ve bulundukları yerle olan kontrastları artırılarak daha belirgin hale getirilebilirler. Mikroorganizmalar boyandıktan sonra, mikroskopta kolay görülebildikleri gibi, büyüklük, şekil, spor, kapsül, internal sütrüktürleri hakkında da gerekli bilgiler elde edilebilir. Ayrıca, boyanma özelliklerine göre de bazı mikroorganizmalar (mikobakteriler gibi) identifiye edilebilirler. Bu nedenle, mikroorganizmaları tanımada, boyama çok önemli role sahiptir. Bunun için çok özel boyama yöntemleri ortaya konulmuştur.

Günümüzde, mikrobiyoloji alanında doğal boyalar (karmin, orsein, indigo, kınakına, v.s) çok az kullanılmasına karşın, sentetik boyalardan çok daha fazla yararlanılmaktadır. İlk sentetik boya, anilinden elde edildiği için bütün sentetik boyalara anilin boyaları adı verilmiştir. Ancak, bunların çoğu anilinden elde edilmediği gibi, anilinle de ilişkili değildirler. Boyalar, genellikle, katran distilasyon ürünü olup benzen derivatlarıdırlar. Benzen halkasında bulunan hidrojen atomları yerine bazı element veya radikallerin girmesiyle çeşitli birleşikler meydana gelir. Örn, bir hidrojen atomu yerine hidroksil (OH) grubu girerse fenol (karbolik asit) oluşur. Diğer hidrojen atomu yerine de metil grubu girerse kresol teşekkül eder. Hidrojen atomlarının yerine metil grubun girmesine göre orto-meta ve para kresol meydana gelir.

Boyaların çoğu organik bileşiklerden olup benzen halkası ile birleşmiş kromofor ve okzokrom gruplarını içerirler. Kromofor grubu ihtiva eden benzen halkasına kromogen halkası denir. Kromogen grubu, birleşiğe boya özelliği verir. Ancak, böyle birleşik renkli olmasına karşın henüz boya karakterine değildir. Çünkü, bu boyanın doku veya lifle bağlanma yeteneği yoktur. Oluşan renk mekanik yoldan kolayca giderilebilir. Gerçek boya haline geçebilmesi için kromofor grubu yanı sıra, diğer grupları da (okzokrom) ihtiva etmesi gereklidir. Bunlar bileşiğe elektrolitik dissosiasyon özelliği kazandırarak, bileşikle tuz oluşumunu sağlar ve kromofor grubunun daha etkili olmasına yardım eder. Örn, nitro (NO2) grubu kromofordur. Benzen halkasındaki 3 hidrojen atomu yerine NO2 grubu girerse tirinitro benzen oluşur. Sarı renkli bir kimyasal birleşik olan bu madde henüz boya değildir ve elektriksel olarak disosiye olmaz. Ancak, benzen halkasındaki diğer hidrojen atomu yerine bir okzokrom grubu (OH gibi) girerse birleşik boya haline dönüşür (pikrik asit) ve boyama kabiliyetini kazanır. Okzokrom grubu, aynı zamanda boyanın daha koyu boyanmasını sağladığı gibi boyanacak cisimle tuz teşkiline de sebep olur. Boyaların bileşiminde bulunan bazı önemli kromofor ve okzokrom grupları şöyledir.

Kromofor grupları

Okzokrom grupları

Azo

- NR2

Nitrozo

- NHR

Azoksi

- NH2

Thiocaronyl

- OH

Nitro

- OCH3

İmino

I

Karbonil

Br

Ethenyl

Cl

Boyalar, boya molekülünün elektrik yüklerine göre, asit, bazik ve nötr olarak üç bölüme ayrılır;

Asit Boyalar

İyonize oldukları zaman, molekülün porsiyonu negatif elektrikle yüklenir. Bunlar da renkli asitlerin tuzlarıdır (genellikle, sodyum tuzu). Bazen potasyum, kalsiyum veya amonyum tuzları olabilir. Asit boyalar arasında, asit fuchsin, safranin, asit pikrik, eosin, v.s bulunmaktadır.

Bazik Boyalar

İyonize oldukları zaman, molekülün boya kısmı pozitif elektrikle yüklenir. Bunlar da renkli bazların tuzlarıdır (genellikle, klorid benzen sulfat, okzalat ve asetat). Bazik boyalardan, metilen mavisi, Jansiyana violet, bazik fuchsin çok kullanılır.

Nötr Boyalar

Asit ve baz boyaların uygun oranda karışımlarından elde edilir (Giemsa, Wright, Leishman vs).

Bakterilerde asit yapıda olan organizasyonları (özellikle, nükleer sistemi ) ve molekülleri boyamada bazik boyalardan fazla yararlanılın. Asit boyalar da sitoplasmayı boyamada kullanılır.

Boyalar içerdikleri kromoforik gruplara göre sınıflara ayırırlar. Bunların başlıcaları şöyledir,

Nitro Boyaları

Bu tür boyalarda kromofor grubunu, NO2 radikali oluşturur ve asit karakterdedirler (pikrik asit, aurantia, martius sarısı).

Azo Boyaları

Azo boyaları başlıca iki kısma ayrılırlar.

I- Monoazo boyaları: Bu tür boyalarda, kromofor grubu azo (-N=N- ) bağı ile benzen halkasına bağlanmıştır ve asit karakterdedirler. Halkaya, OH grubunun katılması asit ve NH2 grubunun ilavesi de bazik karakter yaratır (bordo kırmızısı, brillnat sarısı-S, krisoidin -Y, fast sarısı, janus yeşili-B, metil oranj, metil kırmızısı, oranj-G, oranj -II, Sudan-R, Sudan-II )

2- Diazo ve poliazo boyaları: Molekülde birden fazla azo grubunun bulunması sonu bu tür boyalar meydana gelirler (azo mavisi, biebrich scarlat, bismark braun-Y, brillant purpurin-R, klorazol siyahı-E, kongo kırmızısı, evans mavisi, sudan siyahı -B, sudan kırmızısı -7B, tripan mavisi, vital kırmızısı)

Antrakinon Boyaları

Antrakinon boyaları, anthracen'in oksidasyonu sonu oluşurlar ve anthracen derivatlarıdır (alizarin kırmızısı-S, purpurin)

Tiazol Boyaları

Bu grup boyalarda thiazol halkası vardır ve indamine grubu da kromofordur (geranin-G, primulin, titan sarısı-G, thioflavin-S).

Kuinonimin Boyaları

Bu tür boyalarda 2 kromofor (indamin ve quinonoid halkası) grubu bulunur. Bu grupta:

1. İndamin boyaları: İndamin'in metile olmuş aminoderivatları olup biyolojik öneme sahip değildirler.
2. İndofenol boyaları: İndofenoller, indaminlere yakın özelliktedirler (indofenol, indofenol mavisi).
3. Tiazin boyaları: Tiazin boyaları, sülfür atomuna veya nitrogenlerin biri ile birleşmiş fenil ve quinanoid halkasına sahiptirler (azur -A, azur -B, metilen azur, meliten mavisi, metilen yeşili, metilen violet, thionin, toluidin mavisi-O).
4. Oksazin boyaları: Bu boyalarda, tihazin'in sülfürü, oksijen atomu ile yer değiştirmiştir (birillant-kresil mavisi, kresil violet asetat, gallocyanin, new bleu -R, nil blue sulfat, resazurin).
5. Azin boyaları: Bunlar fenazin derivatları olup 2 tane benzen veya bir benzen ve bir quinonid halkasına sahiptirler. Aminoazinler (neutral red, neutral violet), safrainler (emethyst violet, azokarmin - G, fenosafranin, safranin -O), indulinler (nigrosin).

Fenilmetan Boyaları

Bakteriyolojide çok kullanılan boyalar bu grupta bulunur. Bileşiminde bulunan metanın hidrojen atomlarından biri veya bir kaçı yerine metil, etil veya fenil grupları girer. Eğer 3 hidrojen atomu yerine etil grubu girerse, trietil metan, eğer 2 hidrojen yerine fenil girerse, difenil metan ve 3 hidrojen yerine fenil grubu girerse, trifenil metan boyaları meydana gelir.

1. Diamino trifenil metan boyaları: Kuvvetli bazik karakterde boyalardır (brillant yeşili, fast green FCF, light green-SF).
2. Triamino trifenil metan boyaları: Bu boyalar da kuvvetilce bazik ve bazıları da asit karakterdedir (asit fuchsin, anilin mavisi, bazik füchsin, kristal violet, etil green, etil violet, hofmann violet, metil mavisi).
3. Hidroksi trifenil metan boyaları: Bu boyalar genellikle asit karakterde olup indikatör olarak kullanılır (resolik asit)
4. Difenil - naftil metan boyaları: Bunlar difenil metan boyalarının naftil derivatlarıdır (victoria mavisi -B, victoria mavisi -R, night blue, woolgreen-S).

Ksanten Boyaları

Bu boyalar xanthene derivatları olup bir kısmı asit ve bir kısmı da bazik karakterdedirler. Genellikle indikatör olarak kullanılır. Bu grupta:

1. Pironin boyaları: Bunlar xanthene'nin metile olmuş diamino derivatlarıdır (pyonine -B, pyronine -Y).
2. Rodamin boyaları: Pyroninlere benzeyen bu boyalar 2 amino grup ihtiva etmeleri nedeniyle baziktirler (fast asit blue-R, rhodamine-B).
3. Fluoran boyaları: Bunlar fluorane derivatlarıdır (eosin -B, eosin -Y, etil eosin, eritrosine (mavimsi), eritrosine (sarımsı), fluorescein, merchurochrom 220, phloxine -B, rose bengal).
4. Fenolftalein ve sulfoneftalein boyaları: Bu grupta: bromoklorfenol mavisi, bromokresol yeşili, bromokreosol purpul, boromo fenolmavisi, bromo fenol kırmızısı, bromotimol mavisi, klorokresol yeşili, klorofenol kırmızısı, kresolftalein, kresol kırmızısı, meta kresol purpul, fenolftalein, fenol red, timol mavisi bulunur.

Doğal Boyalar

Doğal boyalar bakteriyolojinin ilk zamanlarında fazla kullanılırdı. Bu gün yerini sentetik boyalara bırakmıştır. Ancak, birkaç tanesi hala kullanılmaktadır. Başlıcaları:

1. İndigo: İndigofera cinsi bitki türleri, indican, denen glukozid ihtiva ederler. Bunun fermentasyonu sonu indigo oluşur.
2. İndigo - karmin: Bu boya indigo desulfonik asitin sodium tuzudur. Asit karakterli olup mavi renklidir.
3. Cochineal: Dişi insekt Coccus cacti'nin ezilmiş ve kurutulmuş tozudur.
4. Karmin: Cochineal'ien alum veya diğer metal tuzları ile muamelesinden elde edilir. Nukleus boyası olarak önemlidir.
5. Orcein: Lecanora tinctoria ve Rocella tinctoria türü likenlerden elde edilir. Bunlar renksiz ve kristal fenolik bileşikler ihtiva ederler. Bunlardan biri orcinol olup orceine çevrilir. Bu, violet - renkli bileşiktir ve hafif asittir.
6. Litmus: Bu madde, ayni orcein gibi, bazı likenlerin soda veya kireç kaymağı ile ve sonradan da ammonia ve hava ile muamelesi sonunda elde edilir. Litmus'un esas maddesi azolitmin'dir.
7.Brazilin: Bu madde brazil ağacı kabuğu ekstraktından elde edilir. İlk elde edildiğinde renksiz ve sonra da okside olunca kırmızı renk alır.
8. Hematoxylin: Güney Amerika 'da yetişen legume türü bitkiden elde edilir. Ağacın, su ile ekstraksiyonu sonucu meydana gelir ve hava ile temasta hemateine dönüşür.

02. Boyama Teorileri

Boyamayı izah için genellikle, fiziksel ve kimyasal temele dayalı görüşler ileri sürülmüştür. Ancak bu günkü bilgilere göre, boyama, ne tam fiziksel ne de tam kimyasal bir karaktere sahiptir. Bunların her ikisinin de kombinasyonudur.

Fiziksel görüş: Bu teoriye göre, boyanma reaksiyonu, kapillarite, ozmosis, adsorbsiyon ve absorbsiyon olaylarına dayanır. Boya ile madde arasında bir bileşik gelişmeden meydana gelen reaksiyon, bu görüşün esasını oluşturur. Bu nedenle, bakteri, solventler içine bırakılırsa veya bunlarla muamele edilirse boya tekrar ekstre edilebilir.

Kimyasal görüş: Hücre içinde bulunan asit ve bazik karakterdeki yapıların, bazik veya asit boyalarla birleşme yetenekleri bulunmaktadır. Böylece boyanma, asit ve bazik sükrüktürlerle oluşan karşılıklı kimyasal ilişkilere dayanmaktadır.

03. Boyama Yöntemleri

Mikroorganizmaları iyi görebilmek ve ayrıntılarını tetkik edebilmek için bir çok genel ve özel boyama yöntemleri ortaya konulmuştur. gerektiğinde, bunlardan en uygunu seçilerek kullanılır.

Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerini başlıca 2 gruba ayırmak mümkündür.

1. Basit boyamalar: Bu tarz boyamada, preparatlardaki mikroorganizmalar hakkında kısa süre içinde bilgi edinmek için tek boya solusyonu kullanılır. Boya, preparata bir defa uygulanır ve bakteriler boyaların karakterine göre boyanırlar. Bu amaçla karbol füchsin, kristal violet ve metilen mavisi gibi genellikle bazik boya solusyonlarından birisi seçilir.

2. Bileşik boyamalar: Birden fazla boyanın iştiraki ile yapılan boyama yöntemleridir. Bunlar arasında:

a) Diferensiyel boyamalar: Mikroorganizmaları birbirinden ayırmada kullanılır (Gram, Ziehl-Neelsen).
b) Sütrüktürel boyamalar: Bakterilerin iç ve dış yapıları hakkında bilgi edinmek için kullanılan bileşik boyama yöntemleridir (spor, kapsül, flagella, çekirdek, lipid, v.s.).

03.01. Basit Boyama Yöntemleri

03.01.01. Karbol Füchsin ile Boyama

Usulüne göre hazırlanmış, kurutulmuş ve fikse edilmiş preparatlar üzerine, karbol füchsin solusyonu, filtre kağıdından süzülerek konur ve 5-10 saniye boyama için bırakıldıktan sonra, boya dökülür ve hafif akan su ile yıkanır. Kurutma kağıdı ile (veya havada) kurutulduktan sonra, üzerine sedir yağı konarak immersiyon objektifi ile bakılır. Mikroorganizmalar kırmızı renkte görülürler.

03.01.02. Kristal Violet ile Boyama

Hazırlanan preparat üzerine boya solusyonundan (kristal violet) konarak 20-30 saniye kadar bekletilir. Sürenin sonunda boya dökülür, preparat su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroorganizmalar mor renkte görülürler.

03.01.03. Metilen Mavisi ile Boyama

Bu amaçla Löffler metilen mavisi solusyonu kullanılır. Preparat üzerine boya solusyonu konarak 5-8 dakika bekletilir. Boya dökülür, yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroplar mavi renkte görülürler.

03.01.04. Negatif Boyama

Bu tür boyama yönteminde mikroorganizmalar değil, saha boyanır. Karanlık olan sahada mikroplar renksiz veya parlak olarak görülürler. Bu amaç için nigrosin veya çin mürekkebi kullanılır. Lam üzerine bir damla boya ve sonra bir damla kültür konarak yayılır ve ince bir froti hazırlanır. Kuruduktan sonra muayene edilir. Bu yöntemden kapsül ve spiroketleri görmek için yararlanılır.

03.02. Bileşik Boyamalar

03.02.01. Gram Boyama Tekniği

Gram tekniği, mikrobiyolojide çok kullanılan bir boyama yöntemi olup mikroorganizmaların klasifikasyonunda ve identifikasyonunda da yararlanılır. Bu gün uygulanan teknik, ilk kullanılan Gram (1884) boyasından biraz değişik şekildedir. Fakat hepsinde de esas aynı kalmaktadır. Laboratuvarda en fazla uygulanan Gram boyama yöntemi şöyledir:

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir
b) Kristal violet (veya metil violet) solusyonu ile 2-3 dakika boyanır.
c) Boya dökülür ve preparat üzerine lugol solusyonu konarak 1-2 dakika beklenir. Lugol solusyonu dökülür.
d) Absolut alkolde dekolere edilir (alkol renksiz akıncaya dek).
e) Su ile yıkanır.
f) Safranin (veya eosin, sulu fuchsin) ile 5-10 saniye boyanır.
g) Su ile yıkanarak boya giderilir.
h) Kurutma kağıdında (veya havada) kurutulur.
i) Sedir yağı konarak immersiyon objektifi ile muayene edilir.Bu yöntemle mor görülen mikroorganizmalar Gram pozitif ve pembe görülenler de Gram negatif olarak değerlendirilirler. Genç kültürlerde bulunan mikroplar, genellikle, kuvvetli Gram pozitif görülmelerine rağmen, eski kültürlerde Gram negatifliğe doğru bir eğilim vardır.

Gram pozitiflik ve negatiflik üzerine birçok görüşler ileri sürülmüştür.

1. Gram pozitif mikroorganizmalar, negatiflerden daha düşük pH limitlerine sahiptirler. Bu nedenle de bazik boyalara karşı affiniteleri fazladır.
a) Asit boya ile Gram pozitif görülen mikroplar, boyanın alkalinitesi artırılırsa Gram negatif olabilirler.
b) Bazik boya ile Gram pozitif görülen mikroplar, boyanın asiditesi artırılırsa Gram negatif olabilirler.
2. Gram pozitiflerden elde edilen lipoidal maddelerin özelliği, Gram negatiflerinkinden farklıdır. Birincide sature olmamış yağ asitleri daha fazladır ve ayni zamanda oksidan maddelere olan ilişkisi de yüksektir. Kullanılan mordanların oksidan olması, bazik boyalara karşı affiniteyi artırır.
3. Gram pozitif mikropların hücre duvarı pepitidoglikan yapısında olup miktarca çok fazladır. Bu strüktür Gram negatiflerde ise çok azdır. Bu tabakanın giderilmesi, Gram pozitif mikropları, Gram negatif hale sokar. Gram pozitiflerde ayni zamanda Magnesium ribonukleate'da fazla bulunur. Bu madde negatiflerde yoktur.
4. Alkolle dekolorasyonun gereğinden fazla yapılması Gram negatifliğe eğilimi artırır.
5. Gram pozitiflerde hücre duvarında teikoik asit vardır.

03.02.02. Asidorezistans Etkenleri Boyama Tekniği

Tuberküloz etkenleri boyamak için önceleri kullanılan Ehrlich (1882) metodu sonradan Ziehl-Neelsen tarafından değiştirilmiştir. Mikroorganizmaların etrafında balmumu tabakasının bulunması, bunların normal boyama yöntemleri ile boyama olanağını ortadan kaldırmaktadır. Bu nedenle boya içine fenol konur ve alttan hafifçe ısıtılarak balmumu tabakası yumuşatılır. Böylece boyayı kolayca alan balmumu tabakası, asit-alkolde dekolore olmaz ve boyayı bırakmaz.

1. Ehrlich-Ziehl - Neelsen (EZN) Mikobakterileri boyama yöntemi
a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Lam üzerine ve bütün lâmı kaplayacak tarzda karbol füchsin solusyonu konur.
c) Preparat alttan 4-5 dakika ve aralıklı olarak hafifçe ısıtılır. Preparatın yanmamasına ve kabarcıkların çıkmamasına dikkat edilir (preparat üzerinden hafif buharlar çıkabilir).
d).Boya dökülür ve preparat asit-alkolde (% 95 alkol + % 3 HCI asit) dekolore edilir.
e) Su ile yıkanır.
f) Preparat üzerine metilen mavisi solusyonu konur ve 10-15 saniye boyanır.
g) Boya dökülür ve su ile yıkanır.
h) Kurutulur ve immersiyonla muayene edilir. Mikobakteriler veya asidorezistens mikroorganizmalar pembe kırmızı renkte ve diğer mikroplar ise mavi renkte görülürler.
Modifiye Ziehl - Neelsen yöntemi (Stamp boyaması), brucella ve chlamydia etkenlerini boyamada da kullanılabilir.

2. Konrich mikobakteri boyama yöntemi
a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Preparat üzerine karbol füchsin konur ve alttan 4-5 dakika hafifçe ısıtılarak boyanır.
c) Boya dökülür ve % 10 sodyum sülfitle renksiz oluncaya dek dekolore edilir.
d) Su ile yıkanır ve % 1 malaşit yeşili ile 15-20 saniye boyanır.
e) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir.
Mikrobakteriler kırmızı renkte ve diğer etkenler yeşil renkte boyanırlar.

3. Mikobakterilerin fluorokrom (auramin-O) ile boyanması
Bu yöntemle auramin-O solusyonu karbol füchsin yerine kullanılır.
a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Auramin-O solusyonu ile 15 dakika boyanır.
c) Su ile yıkanır ve asit - alkolde (alkol % 75'lik + 0.5 NaCL + % 0.5 HC1) dekolore edilir (5 dakika).
d) Su ile yakınır ve KMnO4 (1/1000) solusyonu onarak 30 saniye beklenir.
e) Su ile yıkanır, havada kurutulur ve immersiyonla muayene edilir. Tuberküloz etkenleri sarı-parıltılı olarak görülür.

03.02.03. Spor Boyama

Spor oluşturan mikroorganizmalarda, vegetatif hücre normal boyalarla boyanmasına karşın, sporun etrafında kalın muhafazaların bulunması ve bunların geçirgen olmaması boyanmalarını imkansızlaştırır. Spor boyamak için başlıca iki metot bulunmaktadır.

1. Zeihl-Neelsen Tb. boyama yöntemi ve
2. Malaşit yeşili ile boyama tekniği. Bu son yöntemde:

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Malaşit yeşili (% 5) solusyonu ile, alttan ısıtılarak, 5 dakika boyanır.
c)Su ile yıkanır. Safranin (%0,5) veya füchsin'le 30 saniye boyanır.
d) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir.
Sporlar yeşil ve basiller ise kırmızı renkte görülürler.

03.02.04. Kapsül Boyama

Bakterilerde kapsülleri göstermek oldukça önemli bir sorun olarak görülmektedir. Kurutarak ve tespit ederek uygulanan kapsül boyama yöntemlerinde, genellikle, kapsüller büzülmekte ve iyice seçilememektedirler. Bu bakımdan natif preparat muayeneleri yapmak daha uygundur. Bu amaçla negatif boyama yöntemleri kullanılabilir. Çok temiz ve yağsız bir lam üzerine bir öze dolusu nigrosin veya çin mürekkebi konur ve katı kültür besi yerinden alınan koloni ile suspansiyon yapılır veya sıvı kültürden bir öze dolusu konarak boya solusyonu ile karıştırılır ve üzerine lamel kapatılır. Karanlık saha mikroskobunda mikroplar ve etrafındaki kapsül açık renkte görülür. Bu yöntemle D. pneumoniae, K. pneumoniae muayene edilebilir. Bazı hallerde boyanın kendisi kapsüllü saprofitik mikroplarla kontamine olabilir. Bundan ileri gelecek hatayı önlemek için, boya kullanılmadan önce, tek olarak kontrol edilmelidir.

Yukarıda bildirilen ve kurutulmadan yapılan lam-lamel arası muayene dışında, preparatlar kurutularak da incelenebilir.

a) Temiz bir lâm üzerine % 6 glukoz solusyonundan konur ve mikroorganizma (veya kültür) ile karıştırılır.
b) Bu karışıma bir damla nigrosin (veya çin mürekkebi) ilave edilerek homojen bir hale getirilir.
c) Diğer bir lâmın düzgün kısa kenarı ile ince bir tabaka halinde yayılır ve havada kurutulur.
d) Metil alkolle tesbit edilir.
e) Üzerine metil violet solusyonu konur ve 2 dakika bekletilir.
f) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyonla bakılır.
Bunların dışında, Giemsa ve diğer boyama tekniklerinden de yararlanılabilir.

03.02.05. Flagella Boyama

Flagella çok küçük ve ince olması nedeniyle en iyi elektron mikroskopla ortaya konabilir. Ancak, özel olarak boyanmak suretiyle ışık mikroskobu ile de görülebilecek hale getirilebilir. Bu amaç için, flagella üzerine boya biriktirilerek takriben 10 misli kadar kalınlaştırılır ve kolay görünmesi sağlanır. Flagella için en uygun yöntem modifiye Leifson veya Kodaka tekniğidir. Birinci yöntem için:

a) Çok temiz, yağsız ve pürüzsüz 4-5 lam üzerine önce kalemle alttan halka şeklinde birer daire çizilir.
b) Bu dairelerin içine, formolle inaktivie edilmiş ve santrifüjle 2 defa yıkanarak konsantre edilmiş mikrop suspansiyonundan bir öze dolusu konur (suspansiyon için distile su kullanılır ve en son suspansiyon Brown-1 opasitesinde hazırlanır).
c) Bu suspansiyonların üzerine, özel olarak hazırlanmış tannik asitli basik fuchsin'den 1'er ml. konur ve 6,8,10,12 ve 15 dakika süreyle boyama yapılır.
d) Boya solusyonu çok hafif akan su ile yıkanarak giderilir.
e) Metilen mavisi ile 30 dakika boyanır.
f) Yıkanır, kurutulur ve immersiyonla bakılır. İyi bir görüntü için bazik fuchsin'le olan boyama süreleri ayarlanabilir.

03.02.06. Lipid Boyama

Hücre içindeki lipidleri boyamada, genellikle, sudan siyahı kullanılır (Burdon metodu).

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Preparat üzerine sudan siyahı solusyondan konarak 15 dakikada boyanır.
c) Boya dökülür ve havada kurutulur.
d) Ksilol içinde yıkanır ve tekrar kurutulur.
e) Safranın (% 0,5 veya sulu fuchsin'le 5-10 saniye boyanır.
f) Boya dökülür su ile yıkanır kurutulur ve immersiyonla bakılır.
Mikroskop altında lipid granülleri mavi-siyah veya mavi-gri renkte görülürler. Bakteri protoplasması ise pembe boyanır.

03.02.07. Polisakkarid Boyama

Bakteri ve mantar hücreleri içindeki polisakkarid granülleri, genellikle periodik asit schiff (PAS) ile boyanırlar. Polisakkaridler, periodat vasıtasıyla okside olarak polialdehid haline çevrilir. Bu da Schiff'in füchsin-sülfit'i ile kırmızı renk verir. Protein ve nukleik asitler boyanmazlar. Bu boyadan, aynı zamanda, doku içindeki mantar elementlerini göstermede yararlanılır. Polisakkarid boyamada Hotchkiss yöntemi genellikle fazla kullanılmaktadır. Buna göre:

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve alevde tespit edilir (kesitler için genel fikzatiflerden yararlanılır ve etil alkol (% 70) içinde yıkanır).
b) Preparat periodat solusyonu ile 5 dakika muamele edilir ve sonra alkolle (% 70) yıkanır.
c) Redüktan solusyonla 5 dakika muamele edilir ve tekrar alkolde (% 70) yıkanır.
d) Fuchsin-sulfitle 15-45 dakika boyanır.
e) Sülfit yıkama solusyonu ile 2-3 defa yıkanır.
f) Sulu malaşit yeşili (% 0.002) ile boyanır.
g) Su ile yıkanır, kurutulur ve genel metotlara göre bakılır.

03.02.08. Nukleer Materyalin Boyanması

Bakterilerdeki nukleer materyali boyamada veya bu sistemi göstermede bazı yöntemler uygulanmaktadır. Bunlar arasında en yaygın olanı Robinow tekniğidir.

a) Üremiş kolonileri havi agar bloku kolonili yüzü üste gelmek üzere metil alkol içine 5 dakika bırakılır.
b) Blok çıkarılır ve havada kurutulur.
c) Blok tersine döndürülerek temiz bir lamel üzerine konur.
d) Agar blok kaldırır.
e) Lamel üzerine yapışan mikroorganizmalar havada kurutulur ve ılık alkol-merküri-klorid (Schaudin solusyonu) solusyonuna 5 dakika süre ile bırakılır.
f) Suda yıkanır ve % 70 alkolde bırakılır.
g) Alkolden çıkarılır ve 60 °C de 1 N HCl içinde 10 dakika müddetle tutulur.
h) Önce çeşme suyunda ve sonra da distile suda yıkanır.
i) Sonra, bufferli Giemsa (pH 7) solusyonunuda 37 °C de 30 dakika boyanır.
j) Suda yıkanır, kurutulur ve mikroskopla muayene edilir.

03.02.09. Hücre Duvarı Boyama

Bakterilerin hücre duvarını boyamada aşağıdaki yöntem fazla kullanılmaktadır.

a) Bakterilerden yukarıda bildirildiği gibi impresyon preparatı hazırlanır (lâm üzerinde).
b) Bouvin solusyonu ile fikse edilir.
c) Sonra, % 5-10'luk tannik asitle 20-30 dakika muamele edilir.
d) Kristal violet (% 0,02) ile 1 dakika boyanır.
e) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyonla bakılır.

03.02.10. Spiroketa Boyanması

Spiroketaları boyamada, Fontana, modifiye Becker ve Levaditi yöntemleri kullanılır.

1. Fontana Metodu:
a) Preparat, her biri 30 saniye olmak üzere, 3 defa fiksatifle muamele edilir.
b) Alkolde 3 dakika yıkanarak fiksatif giderilir.
c) Alkolden çıkarılır, süzülür ve alkol giderilir.
d) Üzerine mordan konur ve 30 saniye alttan hafifçe ısıtılır.
e) Distile su ile yıkanır ve kurutulur.
f) Preparat üzerine amonyaklı gümüş nitrat konarak 30 saniye alttan ısıtılır (preparat esmer oluncaya kadar).
g) Distile su ile yıkanır, kurutulur ve Kanada balsamına yatırılır.
Spiroketler esmer-siyah renkte ve mikroskop sahası esmer sarı renkte görülür.

2. Modifiye Becker metodu:
a) Preparat hazırlanır kurutulur.
b) Fikzatif içinde 1-3 dakika bırakılır.
c) Suda 3 saniye yıkanır.
d) Mordanla 3-5 dakika muamele edilir.
e) Suda 30 saniye yıkanır.
f) Boya solusyonu (basik fuchsinli) ile 3-5 dakika boyanır.
g) Suda yıkanır ve kurutulur.

03.02.11. Mantar Boyama

Mantar yönünden muayene, ya direk veya doku kesitlerinde mantar elementleri göstermek şeklinde uygulanır.

1. Direk muayene (Laktofenol pamuk mavisi ile):
a) Lam üzerine bir damla alkol konur.
b) Üzerine iğne ile alınmış mantar elementi konur ve yayılır.
c) Alkolün uçması beklenir.
d) Bir damla boya solusyonu (laktofenol pamuk mavisi) konur ve öze ile hafifçe yayılır.
e) Üzerine lamel kapatılır ve hafifçe bastırılır ve yayılma sağlanır.
f) Boyanın etkilemesi için 10 dakika beklenir ve mikroskop altında muayene edilir.

2. Doku kesitlerinde mantar boyama:
a) Kesitler distile suya bırakılır.
b) Taze hazırlanmış % 1'lik periodik asit solusyonu ile 5 dakika muamele edilir.
c) Hafif akan suda 15 dakika yıkanır ve distile suda çalkalanır.
r) Funchsin sülfit ile 15 dakika boyanır.
e) Hafif akan suda 5 dakika yıkanır ve distile suda hafifçe çalkalanır.
f) Sulu malaşit yeşili ile (veya % 0.1 light green ile) bir dakika boyanır.
g) Alkol içinde dehidre edilir, benzolde berraklaştırılır ve Kanada balzamına yatırılır.

03.02.12. Riketsiya Boyama

Riketsiyaları boyamada Castenada ve Macchiavello boyama yöntemleri genellikle kullanılır.

1. Castenada metodu:
a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve 10 N HCl asit içinde 2 dakika fikse edilir.
b) Distile suda yıkanarak asit giderilir.
c) Formaldehid buffer içinde 1/10 sulandırılmış azur II ile 20 dakika boyanır.
d) Distile su ile iyice yıkanır.
e) Safranın (% 0.25) ile 6-8 saniye boyanır.
f) Su ile yakınır, kurutulur.
Riketsialar mavi, protoplasma ve nukleus ise kırmızı renkte görülür.

2. Macchiavello metodu:
a) Preparat hazırlanır ve havada kurutulur.
b) ve pH. 7.2 - 7.4 olan distile su içinde hazırlanmış % 0.25 bazik fuchsin ile hafifçe ısıtılarak 4 dakika boyanır.
c) Boya hemen % 0.5 sitrik asitle yıkanarak giderilir.
d) Su ile yıkanır.
e) Metilen mavisi (% 1) ile birkaç saniye boyanır.
f) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyonla bakılır. Riketsialar kırmızı ve dokular mavi görülür.

03.02.13. Klamidia Boyama

Klamidia'lar Giemsa, Castenada, Macchiavello boyama yöntemleriyle görülebilir. Ayrıca, Stamp boyama tekniği de uygulanabilir. Bu son teknik:

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Karbol füchsin (1/10) ile 10 dakika boyanır.
c) Asetik asit (% 0.5) ile yıkanarak boya giderilir.
d) Su ile yıkanır.
e) Malaşit yeşili (% 1) ile birkaç saniye boyanır.Klamidia'lar kırmızı renkte ve noktacıklar halinde (tek tek veya kümeler) görülür.

04. Boya Solusyonları

04.01. Metilen Mavisi

1. Stok solusyon : Metilen mavisi 1.5 g ; alkol (% 95) 100 cc. Metilen mavisi bir havana konur, üzerine konan azar miktarlardaki alkolde ezilerek eritilir. Bir şişeye alınan boya solusyonu, 4-5 saat çalkalanır ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülür ve şişelerde saklanır.

2. Kullanma solusyonu (Löffler) : Metilen mavisi (stok) solusyon 33 cc ; distile su (% 0.01 KOH 'li) 100 cc. Önce distile su içine % 0.01 oranında KOH konur ve karıştırılır, sonra da 30 cc stok metilen mavisi solusyonu katılır ve iyice karıştırılır. Bir gün bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülerek cam kapaklı şişelerde muhafaza edilir.

04.02. Jansiyana Moru

1. Stok solusyon : Jansiyana moru 5 g ; alkol ( % 95) 100 cc. Bir havana konulan jansiyana moruna azar azar alkol ilave edilerek ezilir ve erimesi sağlanır. Buradan bir şişeye konarak 4-5 saat çalkalanır ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülür ve cam kapaklı şişelerde saklanır.

2. Kullanma solusyonu (karbollü) : Jansiyana moru (stok) solusyon 10 cc ; distile su (% 1 asit fenikli) 100 cc. Önce fenol distile suda eritilir ve sonra boya ilave edilir. İyice karıştırıldıktan sonra 24 saat bekletilir ve süzülür, cam kapaklı şişelerde saklanır.

04.03. Füksin Boyası

1. Stok solusyon : Bazik fuksin 3 g ; alkol (% 95) 100 cc. Bazik fuksin havanda alkolle ezilip eritildikten sonra bir şişe içerisinde 4-5 saat çalkalanır ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülür ve cam kapaklı şişelerde saklanır.

2. Kullanma solusyonu (karbol fuksin) : Bazik füchsin (stok sol.) 10 cc ; distile su ( % 5 fenollu) 100 cc. Aynı diğerleri gibi hazırlanır veya hep birlikte hazırlanabilir (Ziehl-Neelsen).

Bazik füchsin 10 g ; alkol 100 cc ; distile su (% 5 fenollü) 1000 cc. Bazik fuksin havanda alkolle ezildikten ve fenollü suyun yarısı ilave edilip karıştırıldıktan sonra bir şişeye aktarılır. Geriye kalan su tekrar havana konup iyice yıkandıktan sonra şişeye alınır. 24 saat bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülür ve şişelerde muhafaza edilir.

Sulu fuchsin solusyonu ; Bazik füchsin (stok) 10 cc ; distile su 100 cc ; fuksin distile su ile iyice karıştırılır ve filtre kağıdından süzülür.

04.04. Malaşit Yeşili

Malaşit yeşili 1 g ; distile su 100 cc. Malaşit yeşili havana konur, distile su azar azar ilave edilerek ezilir ve şişeye alınır. Sonra suyun bir kısmı tekrar havana ilave edilerek havan yıkanır ve tekrar şişeye alınır. Bir gün bekletildikten sonra süzülür ve şişelerde saklanır.

04.05. Safranin Boyası

Safranin 0.5 g ; alkol (% 95) 10.0 cc ; distile su 100.0 cc. Safranın alkolle eritilir ve sonra distile su ilave edildikten sonra şişeye konur ve bir gün sonra filtre edilir.

04.06. Bismarck Brown

Bismarch brown (Y) 0.2 g ; distile su 100.0 cc. Boya damıtık su içinde eritilir, süzülür ve şişelerde saklanır.

04.07. Brillant Yeşili

Brillant yeşili 1.0 g ; sodyum hidroksit 0.01 g ; distile su 100.0 cc. Önce distile su içinde sodyum hidroksit eritilir. Sonra brillant yeşili havanda NaOH 'li distile su ile ezilerek eritilir ve süzülür.

04.08. Krisoidin Boyası

Krisoidin 1 g ; distile su 100 cc. Boya, sıcak distile su ile karıştırılarak eritilir ve sıcakken süzülür.

04.09. Pikrik Asit

Pikrik asit 0.75 g ; distile su 100.0 cc. Boya distile su içinde çalkalanarak eritilir. Ertesi gün filtre kağıdından süzülür.

04.10. Eosin Boyası

Eosin 1 g ; distile su 100 cc. Boya distile suda çalkalanarak eritilir ve sonra süzülür.

04.11. Nigrosin

Nigrosin 10 g ; distile su 100 cc. Nigrosin distile su içinde 1/2 saat kaynatılır. İçine 0.5 cc formalin (% 40'lık) koruyucu olarak katılır. Çift süzgeç kağıdından süzülür ve 5 cc miktarlarında ağzı kapalı tüplerde muhafaza edilir.

04.12. Auramin-O

Auramin-O 0.3 g ; fenol (sıvı) 3.0 cc ; distile su 100.0 cc. Önce, fenol distile suya katılır ve hafifçe ısıtılır ve sonra auramin-O katılarak çalkalanır, eritilir ve filtre edilerek, koyu renkli şişelerde saklanır.

04.13. Metil violet - 6B

Metil violet 6 B 5 g ; distile su 1000 cc. Boya distile suya azar azar katılarak ve çalkalanarak eritilir. Filtre kağıdından süzüldükten sonra şişelerde saklanır.

04.14. Flagella Boya Solusyonu

Tannik asit 10 g ; NaCl 5 g ; Bazik fuchsin 4 g. Maddeler birbirleriyle iyice karıştırılır. Karışımdan 1.9 g. alınarak 33 cc alkol (% 95'lik) ilave edilir ve iyice erimesi sağlanır. Distile su ile 100 cc ye tamamlanır. Solusyonun pH 'sı 5.0 'e ayarlanır. Boya kapaklı şişelerde 3 - 5 °C 'de muhafaza edilir.

04.15. Lipid Boya Solusyonu

Sudan siyahı-B (toz) 0.3 g ; alkol (% 70) 100.0 cc. Boya, alkol içinde ara sıra çalkalanarak eritilir. Boya solusyonu bir gece bekletilir. Ağzı kapalı şişede muhafaza edilir.

04.16. Polisakkarid Boya Solusyonu (Hotchkiss Metodu)

1. Periodat solusyonu : Periodik asit 0.8 g ; distile su 20 cc ; Sodium acetat (0.2 M) 10 cc ; etilalkol 70 cc. Maddeler birbirine katılarak eritilir ve karanlık yerde muhafaza edilir.

2. Redükten solusyon : KI 10 g ; Sodyum thiosulfat (penta hidrate) 10 g ; distile su ; 200 cc. Karışım hazırlandıktan sonra 300 cc etil alkol ile 5 cc HCI (2N) ilave edilir. Sülfür presipite olur.

3. Fuchsin - sülfit solusyonu : Bazik füchsin 2 g ; distile su (sıcak) 400 cc.Sıcak su içinde bazik füchsin eritilir ve 50 °C 'ye kadar ılıtılır ve filtre edilir. Buna, HCI (2N) 10 cc ; Potasyum metabisülfit 4 g katılır, karıştırılır, ağzı kapatılarak bir gece bekletilir. Karışma Charcoal (dekolarizan) 1 g ilave edilir ve iyice karıştırılır ve hemen filtre edilir. Tekrar 10 cc veya daha fazla 2 N HCl katılır (preparat kuruyunca pembe olması gerekir).

4. Sülfit yıkama solusyonu : Potasyum metabisülfit 2 g ; HCl (konsantre) 5 cc ; distile su 500 cc. Maddeler distile suya katılarak eritilir (solusyon taze hazırlanır).

04.17. Spiroketa Boyası

I. Fontana yöntemi

1. Tespit solusyonu : Asetik asit 1 cc ; Formalin 2 cc ; distile su 100 cc.

2. Mordant : Fenol 1 g ; Tannik asit 5 g ; distile su 100 cc.

3. Amonyaklı gümüş nitrat: Amonyak solusyonu (% 10), % 0.5 gümüş nitrat solusyonuna bir presipitat oluşup hemen eriyinceye kadar katılır. Bundan sonra gümüş nitrat damla damla katılarak, presipitasyon oluşması ve erimesi beklenir. Presipitat erimeyinceye kadar devam edilir.

II. Modifiye Becker yöntemi

Boyama solusyonu : Bazik fuchsin (alkolde satüre) 45 cc ; Shunk'un mordan-B (% 95 veya % 100 etanol 16 cc + anilin oil 4 cc) 18 cc ; Distile su 100 cc. Maddeler distile su içinde sıraya göre eritilir.

04.18. Mantar Boyama Metodu

Fenol kristal 20 g ; laktik asit 20 cc ; gliserin 40 cc ; distile su 20 cc ; pamuk mavisi (veya metil mavisi) 0.0075 g. Fenol, distile su içinde hafifçe ısıtılarak eritildikten sonra diğer maddeler katılır.

1 Kaynak: Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 51515 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader