Plasmid ve epizomlar

Plasmid  ve  Episomlar

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1

01. Giriş  
02. Plasmidlerin  Genel Karakterleri
 
03. Plasmidlerin Yapısı
 
04. Plasmidlerin Sınıflandırılması
 
05. Plasmidlerin Bakteride Saptanması
 
06. Plasmid DNA'sının İzolasyonu
 
07. Plasmid Eliminasyonu   (Curing, Plasmid Eksklusyonu)
 
08. Plasmid Replikasyonu
 
09. İnkompatibilite
 
10. Nonkonjugatif  Plasmidlerin Transferi
 
11. Plasmid Profil Analizi  (Plasmid Fingerprint Testi)
 
12. Başlıca Plasmidler  ve Özellikleri
 
   12.1. F plasmid (F Faktörü, Seks Faktörü) 
   12.2. Rezistenslik Plasmidleri (R Plasmidleri) 
   12.3. Bakteriyosin Plasmidleri 
   12.4. Virulens Plasmidleri 
   12.5. Metabolik Plasmidler 
   12.6. Büyük Plasmidler  
13. Antimikrobiyallere ve Metallere Dirençlilikte Plasmidlerin Rolü
 
   13.1 Hedef Bölgenin Modifikasyonu 
   13.2. Antibiyotiklerin Modifikasyonu 
   13.3. Antibiyotiklerin Girişinin Önlenmesi 
   13.4. Enzim Substitusyonu 
   13.5. Metallere Dirençlilik  
14. Rekombinant  DNA  Teknolojisinde  Plasmidler
 
 

01.Giriş

Bazı prokaryotik (bakteri) ve ökaryotik organizmalarda (maya, mantar, bitki), kendi büyük kromozomları (genomik DNA) yanı sıra, bundan ayrı,olarak çok daha küçük, DNA karakterinde, çift iplikçikli diğer genetik elementler bulunmaktadır. Bunlar arasında plasmidler de yer almaktadır. Ancak, bu genel tanım içine, bakteriyofajlar, kromozomla

birleşik olan profajlar, transpozonlar, İS-elementleri ökaryotiklerde de mitokondriumlar da girmektedir. Burada, sadece, bakterilerdeki plasmid ve episomlardan bahsedilecektir.

02. Plasmidlerin  Genel Karakterleri

Plasmidler çift iplikçikli otonom DNA molekülleridirler. Şimdiye dek prokaryotik ve ökaryotiklerde RNA (ribonukleik asit) özelliği taşıyan plasmidlerin varlığı bildirilmemiştir. Bakterilerdeki plasmidler genellikle, sirküler, sarmal ve çift iplikçikli bir yapıda olup MA. 1-600 x 106 dalton (1-600 mega dalton, Md) arasında değişmektedir. E. coli 'de bulunan plasmidler, genomik DNA'nın (2.7 x 109 bp, yaklaşık 1.1-1.4 mm uzunlukta) %0.04-%8'i kadardır. Büyük plasmidlere (MA > 50 Md) daha ziyade, Gram negatif mikroorganizmalarda (Pseudomonas, Agrobacterium, vs) rastlanılmaktadır. Streptomyces rochei 'de iki küçük ve lineer morfolojide plasmidin varlığı bildirilmiştir.

B. burgdorferi 'de 4-9 adet lineer ve sirküler plasmidlerin varlığı bildirilmiştir. Lineer olanlar 43, 38 ve 45 kb ve sirküler olanda 26 kb uygunlukta olup bunlar sıra ile  Outer surface protein (Osp)'leri (OspA, B; Osp D; Osp E ve F ile OspC'yi kodlarlar. 110015400.pdf

Ekstrakromozomal materyaller, hücre sitoplazmasında serbest olarak bulunabilecekleri (plasmid) gibi bakterinin kromozomu ile de birleşebilirler. Böyle plasmidlere episom adı verilmektedir. Kointegrasyon, plasmidle genomik DNA arasında oluşabileceği gibi, plasmidle plasmid arasında da meydana gelebilir. Ancak, pratikte, episom ile plasmid eş anlamlı olarak ve daha ziyade plasmid adı altında tanımlanmaktadır. Bazı plasmidler de Col E1 gibi, negatif süpersarmal (süperheliks) bir yapı özelliğine sahiptir ve bu kolisinin E. coli 'de 19-20 süpersarmal bulunmaktadır.

Değişik morfolojilere sahip plasmidlerin (lineer,  sirküler, süpersarmal) gerek agarose gel elektroforezisdeki lokalizasyonları ve gerekse sentrifugasyondaki sedimentasyon katsayıları (S20 W) arasında farklar vardır. Bunlar, sukroz densite gradient (%5-20) sentrifugasyonda, santrifüj tüpünde sukrozun değişik yoğunluğuna sahip yerlerinde toplanırlar. Örn, Col. E1'in lineer formu (15 S) üstte (%5 sukroz), sirküler formu (17 S) ortada ve süpersarmal formu da (23 S) altta (%20 sukroz) lokalize olur. Elektroforezisde ise, süpersarmal form karşı uçta, lineer form ortada ve sirküler formlar ise başlangıç yerine yakın kısımlarda yerleşirler.

Plasmidlerin lokalizasyon yerleri yandaki şekilde gösterilmektedir.

Plasmidler bazı özel genetik bilgileri taşırlar (şifreler halinde). Gerek plasmidlerin kendileri ve gerekse kodladıkları spesifik informasyonların konak bakteri için çok lüzumlu veya hayati önemi yoktur. Bunlar olmadan da bakteriler normal yaşamlarını sürdürürler. Çünkü, plasmidler bakterilere sonradan transfer olmuşlardır ve özel koşullar altında da bakteriden ayrılabilirler. Ancak, bunlar bakterinin genomunda bulunmayan (veya bazen de bulunabilen) bazı özel karakterleri kazandırırlar ve avantajlar sağlarlar: Örn, antibiyotiklere, metallere, ilaçlara dirençlilik, toksin formasyonları, pilus oluşumu, virulens faktörleri, fermentasyon özellikleri, nitrojen fikzasyonunu, vs) bunlardan sadece birkaç tanesidir. Böyle özellikler kazandıran plasmidler bakterilerden ayrılırsa veya çıkarılırsa (plasmid eliminasyonu, plasmid eksklusyonu, curing), bakteriler kazandıkları bu avantajları kaybederler ve bu yönlerden negatif hale gelirler. Örn, C. tetani 'de toksin formasyonu bir plasmid tarafından kodlanır. Bu plasmidin çıkması etkeni nonpatojenik (nontoksijenik) hale getirir. B. anthracis için de durum bir benzeridir.

Bakterilerde doğal olarak bulunan plasmidlerden ziyade, in vitro koşullarda ve amaca uygun olarak kendilerine istenilen özel markerler katılarak hazırlanan suni plasmidler (pBR322, pUC8/9 ve diğerleri) rekombinant DNA teknolojisinde, genlerin klonlanmasında aracı molekül (vektör) olarak fazlaca kullanılmaktadırlar. Doğal plasmidlerin stabilitesine tam güvenilemediği gibi özel markerler yönünden de hem yetersiz ve hem de istenilenleri taşımadıkları için, klonlamada tercih edilmemektedirler.

Büyük plasmidler bir bakteride, genellikle, 1-4 kopya halinde bulunmalarına karşın, küçük plasmidlerin kopya sayısı 20-50'ye ulaşmaktadır (multikopya plasmidler). Ayrıca, plasmidlerin bakteri içindeki kopya sayısını bazı özel teknikler kullanmak suretiyle artırmak mümkündür. Küçük plasmidlerin hemen ekserisi, kromozomla da birleşmediğinden veya sitoplasmada yeterince bulunduklarından, hücrelerden çıkarılmaları oldukça kolay olmaktadır. Bu nedenle gen aktarmalarında da genellikle küçük veya orta boy suni plasmidlerden daha fazla yarar sağlanmaktadır. Hücre içinde kopya sayısının fazla olması, ekspresyon yönünden de avantaj olarak kabul edilmektedir.

Molekül ağırlıkları > 50 Md'den fazla olan büyük plasmidler, hem kendilerini ve hem de taşıdıkları informasyonları ve ayrıca, bazen de konakçı kromozomundan bir segmenti (veya geni), aynı türden veya çok yakın cinse ait türlere transfer etme yeteneğine (bu amaç için gerekli bilgilere veya sekanslara) sahiptirler (konjugatif plasmidler, transmissible plasmidler). Buna karşın, küçük plasmidler (MA < 20 Md) ise, ya aynı bakterideki büyük plasmidlerin yardımı ile veya konakçının genomu ile birleşerek bakteri bölünmesi sırasında kardeş hücrelere transfer edilirler. Bunlardan ayrı olarak, genel transdüksiyonla da küçük plasmidler transfer olabilirler. Bazı durumlarda da, kimyasal ve fiziksel yöntemler kullanarak plasmidlerin bakteriden çıkması kolaylaştırılır ve serbest hale getirilebilirler. Böylece, daha kolay transferleri sağlanır. Küçük plasmidler, kendilerini transfer için gerekli bilgileri kodlamadıklarından bağımsız olarak aktarılmaları mümkün değildir (nonkonjugatif plasmidler, nontransmissible plasmidler). Konjugatif plasmidlerde bulunan seks pilusu formasyonunu kodlayan genler, nonkonjugatiflerde bulunmamaktadır. Bu pilusun gen transferinde çok önemli fonksiyonu vardır.

Konakçı içinde bağımsız replike olabilen plasmidler, sitoplasmik membranda bulunan özel bölgeyi (mesosom), genomla ortaklaşa kullanırlar. Çünkü, bakteri DNA'sının replikasyonuna mani olan mutasyonlar aynı zamanda plasmid replikasyonunu da bloke ederler. Buna karşın, küçük plasmidler bakteri kromozomu ile senkronize replike olmadıkları için böyle mutasyonlardan etkilenmezler. Bunlar ancak, DNA pol I'de oluşan mutasyonlara duyarlıdırlar.

Konjugasyon aparatı (seks pilusu) bir çok plasmid tarafından kodlanmaktadır. Örn, F-faktörü (fertilite faktörü), R-faktörü (rezistanslık faktörleri), Col I ve Col V plasmidleri böyle etkinliğe sahip olanlar arasındadır. Bu faktörlerin kodladıkları piluslar arasında da morfolojik ve antijenik farklılıklar bulunmaktadır. Ayrıca, ayrı faj sistemlerini de adsorbe ederler: Aktarılan plasmidler, alıcının sitoplasmasında ya bağımsız olarak kalırlar veya kromozomla da birleşebilirler.

Aynı gruptan veya aynı karaktere sahip iki tür plasmid, bakteride bağlanma yerlerinin replikasyon sırasında aynı olması nedeni ile, birinin çoğalması diğerinin replikasyonuna mani olur ve buna bağlı olarak ta süper infeksiyon meydana gelemez. Böyle plasmidler birbirleri ile uyuşamadıkları için inkompatible olarak nitelendirilirler. E. coli K12 de, F-faktörü için 8-10,  R-faktörü için iki ve kolisin faktörleri için de değişik sayıda bağlanma yerinin bulunduğu bildirilmiştir.

Plasmidler, aynı fajlar gibi, regulatör sistemlere sahiptirler ve bunlar yardımı ile kendi replikasyonlarını ve diğer özel fonksiyonlarını düzenlerler ve sınırlandırabilirler. Bu nedenle de plasmidlerin bir hücre içindeki kopya sayıları genellikle ayarlanmıştır. Örn, E. coli 'de F- ve R-faktörleri için 1-2 ve proteuslarda ise 10 kopya bulunmaktadır.  

Bir ekstrakromozomal element, bir bakteri de plasmid tarzında bulunduğu gibi, diğer bir bakteride episom halinde olabilmektedir. Örn, F-lac plasmidi, P. mirabilis 'te sitoplasmada (plasmid) bulunur. Bu plasmid E. coli'ye transfer edildiğinde genoma yerleşir (episom). Bir plasmid'in sitoplasmada veya konakçının nukleusuna integre olmasında represör proteinlerin rolü oldukça fazladır.

Plasmidlere enterobakterilerde (Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus vs. türlerinde) fazla sıklıkta rastlanılmaktadır. Bu nedenle bu grup plasmidlere koliform plasmidler adı da verilmektedir. Bu plasmidler, bu grupta bulunan cinslere ait türlere de transfer edilebilirler.

Gram pozitif mikroorganizmalarda da plasmidlere tesadüf edilmiştir. Stafilokoklardaki (S. aureus) penicillinase (beta-lactamase) enzimini kodlayan büyük plasmid buna örnek verilebilir. S. aureus 'ta değişik büyüklükte (küçük veya büyük) plasmidlere rastlanılmıştır. Büyük olanlar genellikle tek kopya halindedirler. Sirküler formda ve tek iplikçikli olan plasmidlerin replikasyonları konakçının genomu ile senkronizedir. Penicillinase plasmidi bir R-plasmididir ve bakteriye dirençlilik kazandırır. S. aureus 'ta bulunan küçük plasmidler (3 Md) tetrasiklin ve kloramfenikola dirençlilikte fonksiyoneldir. Bu plasmidlerin replikasyonları, genomdan bağımsızdır. Diğer bir deyimle hücre bölünmesine bağımlı değildirler. Bu nedenle de bir hücrede çok sayıda kopyası (multikopya) bulunabilmektedir. S. aureus 'taki beta-lactamase ve kloramfenikol asetil transferase enzim üretimi indüklenebilir bir karakter taşımaktadır.

N. gonorrhoeae 'de kriptik plasmid (2.4 Md) olarak tanımlanan genetik elementlerin yapıları ve karakterleri tam olarak belirlenememiştir. Gonokoklarda, beta-lactamase enzim sentezini kodlayan plasmidlerin 3.2-4.4 x 106 dalton oldukları belirtilmiştir.

Beta-lactamase plasmidi, genel transdüksiyonla başka stafilokoklara transfer edilebilir. Hücrede genellikle bir kopya olarak bulunur.

Molekül ağırlıkları 100 Md'den büyük olan plasmidler genellikle 100 polipeptidlik bir zincirin sentezini sağlayacak kadar genetik bilgilere sahiptirler. Plasmidlerin replikasyonları, UV-ışınları ve akridin boyalarına karşı oldukça duyarlıdırlar. Ayrıca, bu faktörler tarafından da bakteriler plasmidlerden kurtulabilirler (iyileşme).

Eğer bir hücrede, biri kendini bağımsız transfer edebilen (konjugatif) ve diğeri de bu yeteneğe sahip olmayan (nonkonjugatif) iki plasmid bulunursa, bunlardan transmissible olanı, diğerini de mobilize ederek aktarılmasını sağlayabilir. Bu olgu, bu iki plasmid, konakçının genomu ile integre olduğunda daha kolaylıkla gerçekleşebilir.

Plasmidlerin transfer olma durumları bunların özel pilus (seks pilusu) oluşturma yeteneğine bağımlı olması yanı sıra, iki bakterinin (alıcı ve verici) direkt teması da gen aktarılmasında etkili olmaktadır. Ancak, seks pilusu yardımı ile gen aktarımı daha fazla sıklıkla gerçekleşebilmektedir. Bakteriler arasında gen transferleri 10-5 -10-7 arasında ve ayrıca türlerin birbirlerine olan genetik yakınlığına göre değişmektedir. Koliform plasmidler, E. coli 'den Proteus türlerine 10-5 oranında aktarılmasına karşın, E. coli 'den E. coli 'ye transfer çok daha sıktır (10-1-10-3).

F-plasmidi, F+ hücre X F- hücre veya Hfr X F- hücre birleşmelerinde, alıcı hücrelere aktarılırken, alıcı bakteriye, plasmid ve/veya bakteri kromozomundan başka herhangi bir sitoplasmik komponent geçmemektedir.

Plasmidler bazı yönleri ile de bakteriyofajlara benzerlik gösterirler. Fajların bazıları bakterinin sitoplasmasında bulunur, burada replike olur fakat konakçısını lize etmez (P1 fajı gibi) veya bir kısmı lize ederek parçalar (litik infeksiyon). Bir kısım fajlar da konakçının DNA'sı ile birleşir (profaj). Bu durum, F faktörünün E. coli  DNA'sına integre olmasına benzer (Hfr hücre).

03. Plasmidlerin Yapısı

Plasmidler, genellikle, konakçı bakteri içinde kendi bağımsız durumlarını koruyabilecek ve devam ettirebilecek gerekli genetik informasyonlara sahip otonom ünitelerdir. Plasmidlerde bulunması gerekli olan en önemli sekansların başında, replikasyonda fonksiyonu olan replikasyon orijini (RO)'ni kodlayan nukleotidlerdir. Aslında, RO'ya sahip olan küçük veya büyük DNA sekansları bağımsız replikasyon özelliği gösterebilirler (replikon). Replikasyon orijini plasmidlerde genellikle tek olmasına karşın, bazılarında R6K plasmidinde 2-3 RO bulunabilmektedir. Küçük plasmidlerin birleşerek oluşturdukları büyük plasmidlerde böyle durumlara rastlanabilmektedir. Ancak, replikasyonda bunlardan birisi fonksiyoneldir. RO'lar, aslında nukleotidlerden oluşmuş bir DNA segmentidir. Bunun uzunluğu, baz sayısı, sırası ve türü plasmidlere göre değişebilir. RO'lar A ve T bazlarından zengindirler.

Aşağıda bazı doğal plasmidlerin kendilerinde bulunan RO sekansları yanı sıra, diğer spesifik markerler de belirtilmektedir.

F plasmidleri : RO + pilus formasyon genler

R plasmidleri : RO + pilus formasyon genleri+antibiyotiklere  dirençlilik      genleri

Virulens plasmidleri :RO + toksin genleri (B. anthracis 'te p0X1 ve Cl. teteni    'de  nörotoksin)

Bakteriosin plasmidleri :RO + Co1E1, Col I, Col V, Pesticin, Cloacin, Megacin  vs. genler

Metabolik plasmidler : RO + bazı kimyasal maddeleri  (SAL, ASL, TOL, NAH, vs) ayrıştıran genler

Plasmidler, bazı restriksiyon endonuklease enzimlerinin kesim yerlerine ve restriksiyon haritalarına sahiptirler. Enzimler, türlerine göre, plasmidlerde değişik sayıda (0,1,2 ve daha fazla) kesmeler yaparak değişik boylarda DNA segmentlerine ayırırlar.

Bazı enzimlerin (Bst II, Hpa I ve Xba I) plasmidde (pBR322) hiç bir kesim yeri bulunmamaktadır. Buna karşın, Hpa II'nin bu plasmidde 26 yerden kesme yeteneği vardır. Ancak, gen klonlanmasında kullanılacak vektörlerde, bazı enzimler için sadece bir kesim yerinin bulunması ve bu yerin de spesifik markerlerden birinin üzerinden olması, genin inaktivasyonu için  arzu edilen bir durumdur (EcoR I, Pst I, gibi).

Çeşitli antibiyotiklere dirençlilik gösteren mikroorganizmalarda, bu özellik, kromozomal bir karakter taşıyabileceği gibi plasmidlerde bulunan özel genler tarafından da spesifiye edilebilirler. Plasmidlerdeki rezistenslik genleri, genellikle, yer değiştirebilen genetik elementler (transposon) tarafından karakterize edilirler. Diğer bir ifade ile, transposonların yapısında antibiyotiklere dirençlilik sağlayan enzimlerin kodları bulunmaktadır.

Doğal plasmidlerin yapısında yer alan önemli sekanslar arasında, replikasyon orijini (RO) başta olmak üzere, özel bazı karakterleri spesifiye eden markerler, transposonlar ve İnsersiyon sekansları (İS-elementleri) da bulunmaktadır. Bu özel sekanslar aynı zamanda genomda var olabilirler.

Gen klonlanmasında, doğal plasmidler, restriksiyon haritalarının ve taşıdıkları spesifik markerlerin uygun olmaması nedeniyle, pek fazla tercih edilmemektedir. Bunların yerine, amaca yönelik olarak gerekli sekanslara sahip (başta RO olmak üzere diğer spesifik markerler) plasmidler hazırlamak ve başarı ile kullanmak mümkündür (suni plasmidler). Böyle plasmidlerin hücre içindeki ekspresyonları da kontrol edilebilmektedir.

E. coli 'ye ait bazı plasmidler yandaki şekilde gösterilmektedir.

Aşağıda, bazı suni plasmidlerde amaca yönelik olarak ilave edilen bazı spesifik markerler gösterilmektedir.

pMB 9 (5300 bp): RO  +  tetr

pBR322 (4363 bp): RO  + ampr+ tetr

pNEO (5510 bp): RO + ampr+ neor

pBR 325 (6000 bp) : RO + ampr + Camr+  tetr

pUC 8/9 (2655 bp): RO + ampr+lac

Gen klonlamasında, yukarda açıklanan sekansların yanı sıra, plasmidlere hücre içinde hedef genin ekspresyonu artırmak için bazı özel baz sıraları, kodonlar, genler vs. daha katılabilir. Örn., yabancı gen (hedef gen), başlatma ve terminatör kodonlar, kuvvetli promotorlar ve bazen de beta galaktozidaz enzimini kodlayan sekanslar. Bunlar, plasmidin hücre içinde kolayca algılanabileceği ve aynı zamanda, RNA polimerase enziminin kolaylıkla tanıyabileceği ve transkripsiyonu yapabileceği nukleotid sekanslarıdır. Hedef gene bağlanan promotor ne kadar kuvvetli olursa genin ekspresyonu da o kadar çabuk ve fazla olur. Promotorlar, aktarılan özel genlerin (hedef genler) önemli ekspresyon güvencesidirler.

Bazı durumlarda da, hazırlanan vektörlerin yapısına hem plasmidden ve hem de fajlardan bazı önemli bölgeler ilave edilerek kapasiteleri genişletilmektedir. Şöyle ki, Kosmidlerde (Cosmid), hem pBR322'ye ait RO ve hem de dirençlilik genlerinden biri veya ikisi bulunduğu gibi, ayrıca, E. coli ‘ye ait olan lambda fajının da Cos (cohesive ends, yapışkan uçlar) bölgeleri katılarak etkinliği artırılmıştır. Kosmidlerde bulunan Cos bölgesi içine yabancı gen aktarılarak E. coli 'ye transfer edilir ve bu hücre içinde genin ekspresyonu sağlanır. Bazen de fajların diğer sekansları da aynı amaç için kullanılarak elde edilen klonlama vektörlerine (fajmid, phagemid) yabancı genler inserte edilerek bakteriye transfer edilir. Örn, pBR322 plasmidine ait RO ve ampr sekansları ile, T3 ve T7 fajlarına ait promotorları taşıyan fajmid (pT7T318U, 2890 bp) gibi.

Buraya kadar bahsedilen vektörler, genellikle "prokaryotik ekspresyon vektörleri ve multifonksiyonel vektörler"olarak tanımlanmaktadırlar. Bunlar için genellikle bakteriler alıcı hücre görevi yaparlar.

Yine benzer tarzda hazırlanan ve hem prokaryotiklerde (bakterilerde) ve hem de ökaryotik hücrelerde eksprese edilebilen, her iki gruba da ait replikasyon orijini, promotor ve diğer sekanslar içeren mekik vektörler (shuttle vector) veya sadece ökaryotikler için özel, ökaryotik ekspresyon vektörleri hazırlanabilir ve ökaryotik hücrelerde klonlanabilir.

Vektörlerin türleri, yapısı ve kullanılmaları hakkında gerekli bilgiler "Mikrobiyolojide Biyoteknoloji" adlı kısımda verilmiştir.

04. Plasmidlerin Sınıflandırılması

Bakteri plasmidleri çeşitli özellikleri dikkate alınarak bazı klasifikasyonlara tabi tutulmuştur. Ancak, yine de tam yerleşmiş ve bütün kriterlere uyabilecek veya cevap verebilecek bir sınıflama yapılmış değildir. Bunlardan bazılarına ait bilgiler aşağıda özetle verilmektedir.

1) Büyüklüklerine göre sınıflama: Bazı araştırıcılar plasmidleri büyüklüklerine veya molekül ağırlıklarına göre 3 gruba ayırmaktadırlar,

a) Küçük (mini sirküler) plasmidler: Bunlar 1-10x106 dalton ağırlığındadırlar

b) Orta plasmidler: Bunlar, 10-50x106 molekül ağırlığındadır.

c) Büyük plasmidler: Bu ölçülerin üstünde molekül ağırlığına sahip olanlar.

Ancak, yukarda belirtilen molekül ağırlığı kriterleri ve isimlendirmeler yazarlara göre değişmektedir. Bu konuda tam bir standardizasyon yoktur.

2) İnkompatibilite durumlarına göre sınıflama: Bakteri plasmidleri, aynı hücrede birlikte bulunup bulunmadıklarına göre iki kısma ayrılmaktadır. Eğer, birden fazla plasmid aynı bakteride uyum içinde bulunabiliyorsa bunlar kompatible grubu içine dahil edilmektedirler. Eğer birlikte uyum içinde olamıyor ve birbirlerini itiyorlarsa bunlar da inkompatible plasmidler olarak kabul edilmektedirler. Bu son grubu, aynı zamanda, birbirlerinin üremelerine veya biri diğerinin replikasyonuna da mani olmaktadır. Plasmidler bu özelliklerine göre gruplara (FI, FII, FIIII, X, PI, Ia, vs) ayrılmaktadırlar. E.coli 'de 20'den fazla, stafilokoklarda 15 ve pseudomonaslarda da 11 inkompatibilite grubu belirlenmiştir.

3) Konjugatif özelliklerine göre sınıflama:  Küçük (1-10 kbp uzunlukta) plasmidler kendilerini bir bakteriden diğerine transfer edebilecek genetik bilgilere sahip değildirler. Bu nedenle nonkonjugatif bir özellik taşırlar. Bunların transferi, aynı bakteri içinde bulunan diğer konjugatif plasmidlerce sağlanır veya bakteri kromozomu ile birleşerek veya genel transdüksiyonla gerçekleştirilir. Bu tür plasmidler, yapılarında seks pilusu formasyonu için de genetik kodlar taşımazlar. Halbuki, büyük plasmidlerin DNA'larında seks pilusu için informasyonlar bulunur ve kendilerini bu pilus aracılığı ile başka hücrelere kolayca transfer edebilirler (konjugatif plasmidler).

4) Taşıdıkları spesifik sekanslara göre sınıflama: Plasmidlerin en önemli özelliklerinden birisi, kuşkusuz, DNA'larında bazı özel informasyonların (markerler) kodlarına sahip olmalarıdır. Konjugatif plasmidler bu özelliklerini transfer edebilme yeteneğindedirler. Bu markerlere göre plasmidler 5 gruba ayrılırlar

1-F faktörü (seks pilusu),

2- Rezistenslik plasmidleri,

3-Virulens plasmidleri,

4-Bakteriyosin plasmidleri

5-Metabolik plasmidler

05. Plasmidlerin Bakteride Saptanması

Bakteriyel populasyonlarda plasmidlerin varlığını belirlemede fiziksel, morfolojik ve fonksiyonel testlerden yararlanılmaktadır.

Bakterilerin, bazı özel karakterleri çabuk kazanması ve bunları nesillere transfer etmesi veya bunları çabuk kaybetmesi, bu özelliklerin plasmidlerce kodlandığının bir işareti olarak kabul edilmektedir. Önceden bazı özelliklere sahip olmadığı bilinen bakterilerin müteakip pasajlarında yeni karakterler kazanması ve bunları yeni nesillere transfer etmesi aynı şekilde bunların plasmidle ilişkili olabileceğini düşündürebilir. Örn, laktoz negatif olan salmonellalarda laktoz pozitif suşların ortaya çıkması gibi.

Nonkonjugatif plasmidler veya herhangi bir özel karakter taşımayan plasmidler yüksek tuz konsantrasyonunda sentrifugasyonu kromozomal DNA ile Plasmid DNA'sını birbirinden ayırmada faydalı olmaktadır. Şöyle ki, iki DNA densite bakımından farklı özellik gösterdiklerinden, santrifüj tüpünde ayrı yerlerde  lokalizasyon gösterirler.

DNA ekstraktları eğer dikkatlice hazırlanır ve DNA'nın parçalanması önlenirse, elektroforezisde iki DNA molekülü ayrı yerlerde lokalize olurlar. Plasmid DNA'sı karşı uçta yer alırken, büyük olan kromozomal DNA başlangıç yerinde (veya buraya yakın) kalır.

Elekron mikroskopla da plasmid DNA'sı kolayca görüntülenebilir. Plasmid DNA'sı kromozomal DNA'dan, büyüklük farkı nedeniyle kolayca ayırt edilebilir.

Sitoplasmada serbest bulunan plasmidlerin saptanması, kromozomla integre olmuşlardan, daha kolaydır. Ancak, nukleusla birleşenleri saptamak için spesifik işaretli problardan yararlanılabilir.

Ethidium bromide içeren caesium chloride densite gradient sentrifugasyonda da sirküler plasmid DNA'sı dibe yakın yerde, kromozomal DNA ise bunun üstünde bant oluşturur.

06. Plasmid DNA'sının İzolasyonu

Bakterinin içinde plasmidin varlığı saptandıktan sonra, kromozom segmentleri ile kontamine olmadan plasmidleri çıkarmak ve bazı özelliklerini belirlemek mümkündür. Bu amaç için, genellikle, sitoplasmada bulunan plasmidler tercih edilirler.

Gram negatif mikroorganizmalardan plasmidleri izole ve karakterize etmek için bazı, pratik ve kolay yöntemler bulunmaktadır. Bunlardan biri aşağıda özetle belirtilmiştir. Yöntemlerin seçimi araştırıcıların becerilerine, bilgilerine göre ve laboratuvar olanaklarına değişebilir.

1) Bakteri içinde, sitoplasmada, plasmidin fazla olması veya kopya sayısının artırılması (besi yerine chloramphenicol 150 mg/ml katılarak) izolasyon için iyi bir başlangıç veya adım olur.

2) Bakterinin sıvı ortamda 18-24 saatlik saf kültürü yapılır ve kuvvetli santrifugasyonla çöktürülür. Üst taraf atılır.

3) Dipteki tortuya EDTA (ethylendiamine tetra acetic acid) katılarak hücre duvarındaki dış membran ve sonra da lizozim ilave edilerek, bu tabakanın altında bulunan ince peptidoglikan katmanı giderilir. Bu iki işlemin sonunda sferoplastlar elde edilir.

4) Sferoplastların hemen parçalanmasını önlemek için ortama sukroz katılır.

5) Suspansiyon, SDS (sodium dodecyl sulfate) ile muamele edilerek sferoplastlar parçalanır.

6) Karışım, RNase ve Proteinase K ile muamelede edilerek ortamda bulunan RNA ve protein karakterindeki moleküller de giderilirler. Böylece, suspansiyonda sadece DNA'lar kalmış olur.

7) Ortamda bulunan hücre artıkları, büyük kromozomal segmentler ve diğer debrisler santrifugasyonla giderilirler. Tortu atılır ve üst taraf muhafaza edilir.

8) Ethidium bromidli caesium chloride densite gradient sentrifugasyona tabi tutularak, plasmid DNA'sı (altta), kromozomal DNA'dan (orta yerde bant oluşturur) ayrı yerlerde bantlar oluşturarak ayrılabilirler. Ancak bu yöntemle kesin bir ayırım yapılamaz. Çünkü, plasmidlerin bazı formları kromozomun bulunduğu yerde lokalize olabilirler.

Ortamın pH'sını 12-12.5 arası ayarlamak plasmid DNA'sı ile kromozomal DNA'yı ayırmada faydalı olabilmektedir. Yüksek pH, kromozomal DNA'yı denatüre etmesine karşın, kapalı sirküler plasmid DNA'sına etkilenmemektedir.

Yüksek tuz konsantrasyonunda kromozomal DNA presipite olmasına karşın plasmid DNA'sı suspansiyon içinde kalır.

Suspansiyon santrifüje edilerek çöken kromozomal DNA'ya pek fazla dokunmadan üstteki sıvı bir pastör pipeti ile çekilerek alınır, saflaştırılır, kontrolleri yapılarak denemelerde kullanılır.

07. Plasmid Eliminasyonu   (Curing, Plasmid Eksklusyonu)

Bakteriler, türlere göre değişmek üzere bir çok spesifik karakterlere sahiptirler. Bu özelliklerin çoğu kromozomal orijinli (genoma bağlı) olmasına karşın, bazıları da plasmidler tarafından kodlanmaktadırlar. Bu iki durumu birbirinden ayırmak için plasmid eliminasyon testi yapılır.

Başlangıçta, bakteride saptanan bazı özelliklerin, eliminasyon denemesinden sonra kaybolması ve böyle durumun generasyonlar boyunca devam etmesi halinde, kaybolan karakterlerin bakteriden ayrılan plasmidlerle ilişkili olacağı anlaşılır. Eğer, hiç bir değişiklik olmazsa, o zaman bu özel karakterlerin kromozoma bağlı olduğu düşünülebilir. Ancak, bu yargıya varabilmek için,

a) Denemenin iyi düzenlendiğinin, yürütüldüğünün ve sonuçlandırıldığının kesinlik kazandırılmasına,

b) Plasmidin bakteride bulunduğunun kesin belirlenmesine,

c) Kullanılan kimyasalların, deneme veya amaç için uygun olduğuna,

d) Plasmidin bakteriden çıktığının belirlenmesine, gereksinim vardır.

Plasmid eliminasyon testinde, genellikle, kimyasal maddeler (acridin orange, acriflavine, ethidium bromide, mitomycin C,optimalin üstündeki ısı derecelerinde üretme, UV-ışınları, iyonizan ışınlar, vs) fazla kullanılır.

Plasmidlerin bakteriden ayrıldığını anlamak için başlıca iki klasik yöntem kullanılmaktadır. Bunlardan biri, plasmid transfer testi olup ortama geçen serbest plasmidler, başka bir indikatör mikroorganizma tarafından alınarak, bu son bakteride görülen yeni değişmeler dikkate alınır. Diğer bir ifade ile, indikatör mikroorganizma, plasmidlerin taşıdığı yeni karakterleri alarak pozitif hale gelirler. Bunda başarılı olabilmek için, indikatör mikroorganizma çok dikkatli seçilir ve ortama CaCl2 katılarak permeabilitesi arttırılır ve böylece transfeksiyon kolaylaştırılır. Bu karakterler, dirençlilik veya metabolik plasmidler, vs olabilir. Diğer teknik ise, selektif ortamların kullanılmasıdır. Özellikle, antibiyotiklere duyarlılığın oluştuğunu veya fermentasyon durumunu ortaya koyabilen özel selektif besi yerleri bu amaç için kullanılabilir

Plasmidler bakterilerden fiziksel ve kimyasal yöntemlerle çıkabilecekleri gibi, spontan olarak ta bakterilerden ayrılabilirler.

08. Plasmid Replikasyonu

Plasmidler, hücre içinde, aynen bir bakteri kromozomu gibi replikasyon modeline sahiptirler. Üzerinde en fazla çalışılan ColE 1 plasmidin replikasyonu hakkında kısa ve özlü bilgiler verilecektir.

ColE I plasmidi (4.3x106 dalton), sirküler, süpersarmal, çift iplikçikli bir DNA molekülüdür. E. coli 'de yaklaşık 15 kopyası bulunur ve her bir 30000 molekül ağırlığında 8 proteini kodlayabilir. Replikasyonu için tümden konakçı proteinlerine gereksinimi vardır. Kendisi ayrıca, Colicin E1 proteinin de kodlarına sahiptir. Bu plasmidin bakteri içinde replikasyonu tek yönlüdür (unidireksiyonal).

Replikasyonun başlangıcında, konakçıya ait RNA polimerase enzimi replikasyon orijininden 555 nukleotid çifti (bp) kadar sol tarafa (5' -ucuna doğru) yerleşerek RNA II sentezini başlatır ve replikasyon için primerlerin sentezi gerçekleştirilir. Bu primerler, Okazaki segmentleri için basamak oluştururlar. Replikasyonun başlangıç noktasında plasmid DNA'sında açıklık  (aralık) meydana gelerek ve polimerizasyon (yeni iplikçik sentezi) oluşan bu açıklık içinde ve tek yöne (unidireksiyonal) doğru gelişerek parental iplikçiklerin karşısında yeni iplikçikler sentezlenerek devam eder ve tekrar orijin noktasına kadar ilerleyerek son bulur. Replikasyonun mekanizması aynen bakterilerde olduğu gibidir. Yani, parental iplikçiğin 5'-ucu karşısındaki yeni sentezlenen iplikçik kesintilidir (ters yöndedir, 3'¬ 5'), buna karşın parental iplikçiğin 3'-ucunun karşısında sentezlenen yeni iplikçik ise 5' ® 3' yönündedir. Bu yön polimerase enziminin aktivite yönüne uygun olduğu için sentez kesintisizdir. Diğer iplikçikte ise, primerler ve Okazaki segmentleri meydana gelir.  R-plasmidlerinden olan R1, R100 ve R6-5'de unidireksiyonal replikasyon tarzı bulunmaktadır.

E. coli 'ye ait bazı plasmidlerin (özellikle konjugatif karakterde olanlar) replikasyonu iki yönlü olabilmektedir (bidireksiyonal). Bu model replikasyon, bakteri kromozomunun sentezine aynen uymaktadır. Replikasyon çatalı iki yönde ilerleyerek belli bir noktada birbirleriyle birleşirler.

Plasmidlerde replikasyon orijini genellikle, tek olmasına karşın bazı F-plasmidinde iki ve R6K'de ise 3 tane RO'nun bulunduğu açıklanmıştır.

09. İnkompatibilite

Bakteriler, genellikle, aynı tür plasmidin bir veya daha fazla kopyasına sahip olabilmektedirler. Büyük plasmidler 1-2 kopyadan fazla olmamalarına karşın, küçük plasmidler hücrede daha fazla (> 20) sayıda bulunabilmektedirler. Bir arada olabilen ve çoğalabilen bu plasmidler birbirleri ile uyum içinde bulunurlar (kompatibilite). Ancak, bazı plasmidler aynı bakteride bulunamazlar, birbirlerinin üremelerini kısıtlarlar veya eliminasyonlarına neden olurlar (inkompatibilite). Örn. E. coli 'ye ait olan F plasmidi ya sitoplasmada serbest olarak veya bakteri kromozomu ile birleşik olarak (Hfr hücre) bulunur. İki tarz birlikte E. coli 'de bulunamaz. Bir bakteriye inkompatibl iki plasmid transfekte edildiğinde, 2-3 generasyon sonra bunlardan biri çıkarılır ve tek tür plasmid haline gelir. Böylece biri elimine edilir. Genellikle, aynı tür plasmidler birbirleri için inkompatibil bir karakter taşırlar.

Ancak, gen klonlanmalarında bazen gen amplifikasyonunu sağlamak amacıyla aynı plasmidin çok sayıda kopyası elde edilebilmekte    (kloramfenikollu bezi yerinde üretilerek) veya küçük plasmidlerin bir bakteride çok sayıda kopyası bulunabilmektedir.  Böyle durumlara, bir bakteri de aynı plasmid için birçok replikasyon yerinin olmasının rolü yanı sıra diğer bazı faktörlerinde etkinliği vardır.

İnkompatibilite olgusu, hücrelerde plasmid replikasyonu ve plasmidin bölünen iki hücreye taksimini kontrol eden mekanizma ve ayrıca, plasmidlerin kopya sayısı ile yakından ilişkilidir. Bir bakteride bulunan replikasyon mekanizması bir plasmid tarafından kullanılıyor ve bloke ediliyorsa, aynı mekanizmadan yararlanan ikinci plasmid bu olanağa sahip olamadığı için replike olamaz (kompetatif inhibisyon). Bu durum aynı zamanda, aynı plasmid ile ikinci infeksiyona da mani olur (immunite). ColE1 plasmidinde inkompatibilite, RNA I olarak tanımlanan moleküllerle ilişkili bulunmaktadır. Bu molekülün RNAII ile interaksiyonu, DNA'nın replikasyonunu önler. Böylece, plasmidin replikasyonu sınırlanır. Eğer her iki plasmid, aynı RNAI ve RNAII moleküllerini spesfiye ediyorsa, RNA I'in hücre içindeki konsantrasyonu, her iki plasmidin kopya sayısını dengede tutar.

İnkompatibilite özelliği, plasmidleri sınıflamada yardımcı olmaktadır. Enterobakterilerde 30, stafilokoklarda 15 ve pseudomonaslarda en az 11 inkompatibilite grubu belirlenmiştir.

10.Nonkonjugatif  Plasmidlerin Transferi

Konjugatif plasmidler kendilerini transfer edebilmek için gerekli informasyonlara sahip olmalarına karşın nonkonjugatif olanların böyle bir yetenekleri bulunmamaktadır. Ancak, konjugatifler, kendilerini transfer ettikleri oranda, nonkonjugatifleri de mobilize ederek transferlerini sağlayabilirler. Örn., nonkonjugatif bir plasmid olan ColK-235 (MA: 5x106), konjugatif olan R144 drd3 plasmidi tarafından ve ColE 1 nonkonjugatif plasmidi de F- veya I-benzeri konjugatif plasmidleri tarafından transferleri sağlanır.

Mobilizasyon bazı durumlarda, ne konjugatif plasmide bağlanarak bununla birlikte (kotransfer) ve ne de bakterinin recA gen ürünü proteinine bağımlıdır. Kendilerinin mobilizasyonunu sağlayan konjugatif plasmidler bu amaç için en az bir proteinin kodlarına sahiptirler.

11. Plasmid Profil Analizi  (Plasmid Fingerprint Testi)

Bu test, bakterilerde plasmidlerin varlığını ortaya koyduğu gibi plasmid türlerini belirlemede de yardımcı olmaktadır. Bakterilerde aynı molekül ağırlığında olanlarla farklı olanların fingerprintleri, agarose jel üzerinde farklı yerlerde lokalizasyon gösterdiklerinden, bu durumları teşhiste büyük kolaylıklar sağlamaktadır.

Bu test kısaca şöyle uygulanır.

1) Plasmid taşıyan bakterinin sıvı ortamda (veya agarda) taze kültürü yapılır.

2) Kültür santrifüje edilerek tortu (mikroorganizmalar) lize edilir.

3) Plasmid DNA ile bakteri DNA'sı birbirinden ayrılır.

4) Plasmid DNA'sı, agarose jele tatbik edilerek elektroforetik seperasyona tabi tutulur.

5) Jel, metilen mavisi (veya başka bir boya ile) boyanır ve UV-ışınları altında boyanan bantlar kontrol edilir.

6) Bantların yerleri belirlenir (Farklı büyüklükteki plasmidler değişik yerlerde bant oluştururlar).

Küçük plasmidler jel içinde daha hızlı hareket ederek karşı uçta yerleşmelerine karşın büyük plasmidler de molekül ağırlıklarına göre başlangıç yeri ile karşı uç arasında bir lokalizasyon gösterirler. Bantlar, "standart plasmid molekül ağırlığı" ile karşılaştırılarak bantların yerleri ve  molekül ağırlıkları saptanır.

Aşağıda moleküler ağırlık standardı olarak kullanılan bazı plasmidler ve bunların molekül ağırlıkları gösterilmektedir.

12. Başlıca Plasmidler  ve Özellikleri

Bakterilerde, karakterleri çok değişik olan doğal plasmidler bulunmaktadır. Taşıdıkları özel genlere dayalı olarak bunları 6 grup altında incelemek mümkündür.

1) F plasmidi (fertilite faktörü, F faktörü, seks faktörü)

2) Rezistenslik plasmidleri (R plasmidleri, R faktörleri)

3) Virulens plasmidleri

4) Bakteriyosin plasmidleri

5) Metabolik plasmidler

6) Büyük plasmidler

12.1. F plasmid (F Faktörü, Seks Faktörü)

F faktörü (fertilite faktörü) en iyi E. coli K 12 suşlarında incelenmiştir. Bir plasmid olan F faktörü, sirküler, sarmal ve çift iplikçikli otonom bir DNA molekülüdür (MA: 63x106 dalton, 95 kbp uzunlukta ve hücre de 1-3 tane kadar). Konak bakterisinin yaklaşık %2'si kadar uzunlukta olan bu plasmid, yapısında replikasyon orijininden (RO)'dan ayrı olarak kendisinin transferini sağlayabilecek ve pilus formasyonunu kodlayan bilgilere sahiptir (Tra operonda 21 gen). Bu plasmid hangi hücreye aktarılırsa, o bakteride hücre membranında pilus sentezi (pilus formasyonu) meydana gelir. Bu pilus (seks pilusu), bu faktörü taşımayan alıcı hücrenin (F- hücre), verici hücre ile (F+ hücre) bağlantı kurmasına ve bir konjugasyon köprüsü oluşturmasına yardımcı olur. F faktörü konjugatif (transmissible) bir plasmiddir.

F faktörü bakterinin sitoplasmasında bulunabileceği gibi, konakçının genomuna da integre olabilir ve Hfr (high frequency recombination) hücre meydana gelir.

F plasmidi ile başlıca 3 tür konjugasyon oluşabilmektedir. Bunlar da,

1) F+ hücre x F- hücre konjugasyonu: F faktörünü sitoplasmasında taşıyan bir F+ hücre ile buna sahip olmayan F- hücre arasında gerçekleşen F faktörü aktarılmasında seks pilusu önemli fonksiyona sahiptir. Ancak, böyle iki hücrenin direkt teması da genetik madde aktarımına yardımcı olabilmektedir. F+ hücre x F¯ hücre birleşmelerinde genin aktarımı tek yönlüdür. Yani vericiden alıcıya doğrudur. İki yönlü olmamaktadır. Ayrıca, F+ hücre ile F- hücre birleşmelerinde de alıcı hücre her zaman F+ hücre şekline dönüşmeyebilir. Konjugasyon sırasında, F faktörünün bir iplikçiğinde oluşan kopma (ori T bölgesi) ve buradan ayrılan 5' ucu, seks pilusunun oluşturduğu köprüden geçerek F- hücreye transfer edilir. Aktarılan tek iplikçiğin karşısında 5' ¬ 3' yönünde ikinci bir iplikçik sentezlenerek alıcı hücrede çift iplikçikli ve sonra da sirküler forma dönüştürülür. Böylece başlangıçta F- olan alıcı hücre F+ hale dönüşmüş olur. Vericide bulunan tek kopya da rolling circle replicationla çift iplikçikli forma getirilir. Böylece verici hücre de yine plasmid kalmış ve bu hücre F+ karakterini korumuş olur.

Alıcı hücreye aktarılan F plasmidi, burada sitoplasmada kalır. Nadiren bakterinin genomuna da integre olabilir ve hücreyi Hfr haline getirebilir veya bazen de hücreden ayrılabilir.

Genetik materyalin, vericiden alıcıya aktarılmasında seks pilusunun çok önemli fonksiyonu olmasına karşın, aktarım bazen, direkt temas sonunda da meydana gelebilmektedir.

2) Hfr hücre x F-hücre konjugasyonu: F faktörünün alıcı hücrenin kromozomu ile birleştiği durumlarda, bakteride seks pilus formasyonu çok daha fazla sıklıkta meydana gelir ve buna bağlı olarak ta gen transferi çok daha yüksek oranda gerçekleşir. Hfr hücrelerde, kromozom üzerinde lokalize olan F faktöründe iplikçikte oluşan kopma sonu ayrılan 5'-ucu konjugasyon köprüsüne girerek buradan alıcı (F- hücre) hücreye transfer edilir. Ancak, bağlı bulunduğu konakçı genomundan da bir segmentin veya nadiren tüm kromozomun da, tek iplikçik halinde, alıcıya aktarılmasını sağlayabilir. Alıcıya geçen tek iplik F faktörü ve/veya kromozom segmenti burada çift iplikçikli ve sirküler forma dönüştürülür. Vericide kalan tek iplikçik F faktörü rolling circle replication ile çift iplikçik haline getirilir. Eğer genomdan bir segment (tek iplikçik) gitmişse, bu da karşı iplikçik kalıp olarak kullanılarak yeni iplikçik sentezlenerek çift iplikçikli hale getirilir.

Alıcı hücreye aktarılan F faktörü veya F faktörü + kromozom segmenti, ya alıcı hücrenin genomuna integre olur ve bu hücreyi de Hfr haline getirir veya F plasmidi, hücre sitoplasmasında da kalabilir.

F+ hücrelerden F- hücrelere aktarılan F plasmidinin alıcı hücrenin kromozomu ile integre olma olasılığı 10-5-10-6 arasındadır. Kromozomla birleşme geriye dönüşlü de olabilir. Yani F faktörü genomdan ayrılabilir. DNA transferi belli bir hız ve belli bir yerden başlayarak devam eder. Bu hız 37°C 'de bir saat içinde yaklaşık 105 nukleotid çifti kadar olduğu belirlenmiştir.

F+ hücrelerden alıcıya F faktörünün transferi oranı genellikle düşüktür. Çünkü, pilus formasyonu, Hfr hücrelere göre daha azdır, Ayrıca direkt  kontakla yapılan transferlerde de, sıvı ortamda bakteriler serbest olarak bulunduklarından ve aralarında az da olsa bir mesafe olduğundan direkt temas oldukça sınırlı kalmaktadır. Bazı durumlarda mikroorganizmalar sıvı ortamda kümeler tarzında veya birbirlerine bağlı olarak da üreme gösterebilirler. Ancak, böyle kümeler tek bir mikroorganizmadan oluşması nedeniyle hepsi aynı karakteri yani hepsi F- olabilirler. Katı ortamlarda da üreyen koloniler, aynı şekilde, tek bir mikroorganizmadan kaynaklandığı için aynı sorun burada da bulunmaktadır.

F faktörü, sadece E. coli suşları arasında transfer edilmez. Aynı zamanda, salmonella, shigella, pseudomonas, proteus, vs cinslerine ait türlerde de meydana gelebilir. F+ E. coli suşları diğer  Gram negatif mikroorganizmalarla da konjugasyon yapabilir. Ancak; daha az sıklıkta bir gerçekleşme elde edilir. Örn, E. coli ile salmonella arasındaki konjugasyon oranı 10-6-10-8 kadardır. Salmonella ile shigella arasında da buna benzer bir oran bulunmaktadır.

F faktörü bazı indükleyicilerin (akridin boyaları, ethidium bromide, mitomycin C, vs) etkisinde veya spontan olarak bakteriden çıkabilir (eliminasyon, plasmid eksklusiyonu). Böylece, F+ hücreler F-  hücre haline gelebilirler.

3) F' hücre x F- hücre konjugasyonu: Bazı indükleyicilerin etkisi altında, Hfr hücrelerinde kromozomda yerleşik bulunan F plasmidi buradan ayrılabilir. Bu ayrılma tam veya kısmi olabildiği gibi bazı durumlarda da kromozomdan da bir segmentin veya genin birlikte çıkmasına neden olabilir. Kısmi ayrılmalarda ise, plasmidin bir bölümü bakteri kromozomu üzerinde kalır.

Yandaki şekilde konjugasyon aşamaları gösterilmektedir.

Bakteri genomundan bir segmentin F plasmidi ile birlikte çıkması (F' plasmidi) durumunda oluşan F' hücre ile F- hücre konjugasyonlarında, bakteri genomu da alıcı hücreye çok nadiren transfer edilebilir ve bu bakteriyi, aktarılan faktör yönünden pozitif hale getirebilir. Ancak, çoğu kez bakteri segmenti transfer edilmez veya aktarılsa bile kromozomla birleşmeyebilir.

Konjugasyonun önemli olan yanlarından biri de, kesintili konjugasyon denemeleri ile bakterinin zamana karşı kromozom lokalizasyonlarının haritasını yapmak mümkündür. Böylece hazırlanan kromozom haritalarında hem genlerin yerleri ve hem de aktarılma süresi içinde zamanları da belirlenmektedir.

F faktörünün bakteri kromozomuna integrasyonunda her ikisinde bulunan İS-elementlerinin rolü olduğu bildirilmektedir. Bakterideki İS-elementi ile F plasmidinde bulunan İS-elementi karşılıklı gelerek çapraz integrasyonla F faktörü kromozoma integre olur.

12.2. Rezistenslik Plasmidleri (R Plasmidleri)

Enterobakteriler arasında çeşitli ilaçlara karşı dirençlilik, hem in vitro ve hem in vivo olarak saptanmıştır. İlk defa bu özellik, 1951 yılında Japonya'da seyreden bir dizanteri olgusundan izole edilen S. flexneri suşunun 4 antimikrobial maddeye (kloramfenikol, tetrasiklin, streptomisin ve sulfonamid) karşı dirençli olduğu belirlendikten sonra anlaşılmıştır. Bu etkenin dışında, birçok ilaca karşı çoğul dirençlilik E. coli, salmonella, shigella, Klebsiella, proteus ve bazı enterobakterilerde de rastlanmıştır. Daha sonraları antibiyotik sayısında, dirençlilik yönünden artmalar olmuş ve yukardakilere ilaveten ampisilin, kanamisin, neomisin, vs gibi antibiyotiklere çoğul dirençlilik gösteren suşların sayısında artmalar meydana gelmiştir.

R plasmidleri çift iplikçikli sarmal, sirküler  ve yapıda DNA karakterinde genetik elementlerdir. Molekül ağırlıkları >50x106 kadar olup genellikle konjugatif bir özelliktedirler  Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler.

R faktörleri iki bölümden oluşurlar. Biri konjugasyonu ve aktarılmayı yöneten transfer faktörü (TF) ve diğeri de çeşitli ilaçlara karşı dirençliliği tayin eden rezistenslik faktörü (RF) veya R determinanttır. E. coli 'de bu iki faktör tek bir ünite halinde bulunmasına karşılık salmonella ve proteuslarda bunlar ayrı sekanslar halindedirler. Bu faktörler birbirlerinden bağımsız olarak aktarılabilirler ve akridin boyalarından da ayrı ayrı etkilenirler. Eğer, RF transfer edilirse alıcı hücre ilaçlara karşı dirençli hale gelir. Ancak, RF'nin, TF olmadan tek başına aktarılması olanaksızdır. Bu nedenle RF'nin aktarılması diğer mekanizmalar tarafından yönetilir.

Patojenik bakteriler, kendilerinde bulunan R faktörlerini nonpatojenik olanlara transfer edebilir. R plasmidleri, aynı zamanda, bazı faktörleri, diğer plasmidlerle birleşerek veya transpozonlardan alabilirler. Bazıları da R faktörlerini amplifiye edebilir veya plasmid sayısı (kopya sayısı) artırılabilir. Böylece bakteriler arasında rezistenslik konsantrasyonu çoğalmış olur.

RF ve TF'yi ayrı üniteler halinde bulunduran suşlarda ya biri veya ikisi birlikte transfer edilebilir.

R faktörleri, etkilerine göre karakterize edilebilirler. Bazıları fertiliteye mani olur ve F pilus oluşumunu baskılar (fi+, fertilite inhibisyon pozitif), bazıları da etkilemez (fi-, fertilite inhibisyon negatif). Ancak, fi+ faktörü, F faktörünün aktivitesini sınırlandırır. Buna karşın, fi-, F faktörünün etkinliğine tesir etmez. Bazen de bir hücrede fi+ ve fi- faktörleri bir arada bulunabilirler. Bu durum, aynı hücrede her iki faktörün replikasyon için aynı bağlanma yerine sahip olmadıklarını göstermektedir.

R faktörü taşıyan hücrelerde, F piluslarına benzeyen piluslar (R pilusu) oluşmaktadır(R-plus formasyonu). Bu pilus da R faktörünü transferde bir konjugasyon köprüsü oluşturur ve genetik materyalin aktarılmasında önemli rol oynar. R faktörü, çeşitli antibiyotiklere karşı dirençliliği tayinde rol alan genlere sahiptir. Şimdiye kadar, 7-8 antibakteriyel maddeye karşı rezistenslik tespit edilmiş olup bunların da tek bir R faktöründe toplanabileceği belirlenmiştir. Bir bakteride, ilaç dirençliliği oluşursa, bu zamanla çok yönlü R faktörüne dönüşebilir ve diğer Gram negatiflere de aktarılabilir. Antibiyotikler alındığında, bunlara duyarlı olan mikroorganizmalarda azalmalar meydana gelirken, dirençliler de ise bunların yerini alma ve çoğalma gözlenir. Bu arada, R faktörünün de hem patojenik ve hem de nonpatojenik Gram negatiflere transferi artar. Böylece, barsakta, R faktörünü taşıyan hücre sayısı çok fazla bir düzeye ulaşır, komensal ve patojenikler arasında yaygın bir hale gelir ve hastalığın nüksüne yol açar.

Bu tarz infeksiyonlara, Gram negatif etkenlerden ileri gelen infeksiyonların sağaltımında kullanılan streptomisin uygulamasından sonra rastlanmaktadır.

R faktörünün bir kısmı, zamanla, spontan olarak veya antibiyotik baskısının kalkması sonu, konakçı bakteriden ayrılabilir. Spontan kaybolmalarda R faktörünün, kromozomla aynı anda bölünerek kardeş hücrelere aktarılması da rol oynar.

P. multocida, S. aureus, Salmonella, Shigella, genellikle, ilaçlara duyarlı, buna karşın Pseudomonaslar ise dirençlidirler.

Mutasyonlar sonu da, antibiyotiklere karşı dirençlilik oluşabilmektedir. Ancak, bu tarz rezistenslik, yukarıda açıklandığının aksine, ekstrakromozomal değil kromozomaldir.

Bakterilerde bulunan restriksiyon endonuklease enzimleri yabancı orijinli genetik materyallerin invazyonuna mani olur. Ancak, bu koruma işlevi her zaman başarılı olmaz ve yabancı DNA segmentleri hücrelere girer ve kromozomla da birleşebilir ve mutasyonlara da yol açabilir.

R faktörü, R+ hücrelerden R- hücrelere genellikle, konjugasyonla transfer olmasına karşın Gram pozitiflerde (stafilokoklarda) genel transdüksiyonla aktarma meydana gelir.

R faktöründeki çoğul dirençlilik, bunda bulunan transpozon (Tn) ve/veya İS-elementlerinden kaynaklanmaktadır.

Çeşitli antimikrobial ilaçlara ve metallere karşı dirençliliği sağlayan ve R plasmidlerince kodlanan özellikler ve bunların mekanizmaları hakkında ayrı bir bölüm halinde, bu kısmın  sonunda, bilgi verilmektedir.

12.3. Bakteriyosin Plasmidleri

Bakteriyosinler, bazı bakteriler tarafından sentezlenen dar spektrumlu ve letal etkili proteinlerdir. Bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal olmasına karşın, bazıları da plasmid orijinlidirler. Bakteriyosinler, ancak, kendini sentezleyen türden veya konakçısına çok yakın olan mikroorganizmalara etkilidirler. Örn., E. coli tarafından sentezlenen colicin (kolisin, bakteriyosin), bunu sentezleyemeyen E. coli 'ler ile S. sonnei  için letaldir. Ancak, diğer bazı enterobakterilere de etkili olabilmektedir. Bu etki çok sınırlıdır. İnsan ve hayvanlardan izole edilen E. coli suşlarının yaklaşık %40 kadarının kolisinojenik olduğu belirtilmektedir. Şimdiye kadar 20'den fazla ve ayrı özellikte kolisin izole edilmiş olup bunlar A'dan V'ye kadar, büyük harflerle bir sıralamaya tabi tutulmuştur. Bunların her biri, E. coli 'lerin bazılarına etkili olmakta ve böylece bir konakçı spektrumu ve spesifitesi meydana gelmektedir. Kolisin sentezleyen suşlar (kolisinojenik suşlar) kendi  oluşturdukları kolisinlere dirençlidirler. Ancak, kolisin sentezlenmeyenler etkilenirler.

Bakteriyosinler, Gram negatif mikroorganizmaların yanı sıra bazı Gram pozitiflerce de (stafilokok, streptokok, listeria, basiller vs) sentezlenebildikleri açıklanmıştır.

Bakteriyosin formasyonu için, bakterilerde, özel, bakteriyosinogenlerin bulunması gereklidir. Bunlar, bakteriyosin sentezini spesifiye eden özel genler olup bir kısmı ekstrakromozomal bir karakter taşırlar. Bir çok bakteride böyle genler bulunmasına karşın, genellikle, baskı altında tutulurlar ve bakteriyosin oluşturmazlar. Bu nedenle de hücre filtratlarında bakteriyosinlere çok az rastlanır ve bazen de hiç bulunmayabilirler. Ayrıca, bazı bakteriyosinojenik suşlar da, aynen bakteriyofajlarda olduğu gibi (lizojenik suşlar), bakteriyosin sentezi için indüklenmeleri gerekmektedir. Bakteriyosin sentezleyen hücrelerde, özel bir pilus formasyonuna rastlanmamaktadır. Bunları kodlayan genler, ancak F veya R faktörlerinin oluşturdukları pilusların konjugasyon köprülerinden yararlanarak diğer bakteriye aktarılabilirler. Fakat, Col E1 pilus formasyonunu tayin edebilir ve kendinin transferini sağlayabilir. Bunun yanı sıra, çok az oranda da bakteri kromozomundan bir segmenti de mobilize edebilir ve aktarıldığı hücreye taşıyabilir. Ancak, kromozoma integre olmazlar.

Bazı kolisinler (Col E1), bazı E. coli suşlarında bulunan özel bir plasmid (Col plasmidi) tarafından spesifiye edilirler. E. coli 'lerin genomunda doğal olarak kolisin sentezleyen bir gene rastlanamamıştır. Ancak,  kendilerine kolisin geni transfer edilirse böyle E. coli 'ler kolisin genini eksprese edebilirler.

Col plasmidi kendi konakçı bakterisini, aynı kolisine karşı dirençli hale getirmesine karşın, diğer kolisinlere duyarlı olabilirler. Örn., Col1 A plasmidi E. coli 'yi colicin A 'ya karşı dirençli yapmasına karşın, colicin B ve diğer kolisin türlerine duyarlıdır.

Kolisinler, etkilerine göre, E. coli 'ler, Fredericq tarafından 20 farklı tipe ayrılmış ve bunlara A'dan V'ye kadar bir isim verilmiştir (Freedericq klasifikasyonu). Bu sistematikte, E. coli 'lerin dirençlilikleri esas alınmıştır. Ancak, bu sistematik pratiğe pek uymamaktadır. Şöyle ki, bir E. coli suşu, birden fazla türden kolisin sentezlediği gibi, birden fazla türden kolisini kodlayabilmektedir.

Bakteriyosinler düşük molekül ağırlığında ve protein karakterinde substanslar olup her birinin amino asit sıraları ile bazılarının bunları kodlayan genlerin bazılarının baz sıraları saptanmıştır. Yapıları oldukça basit, karbonhidrat ve lipid molekülleri yönünden de bazıları yoksundurlar. Bu nedenle bakteriyosinlerin plasmidler tarafından spesifiye edilip-edilmediklerini saptamak oldukça kolay olmaktadır.

Gram pozitiflerce sentezlenen bazı bakteriyosinler, ayrı cinsten mikroorganizmalara da az da olsa etkili oldukları açıklanmıştır. Ancak, bu özellikteki bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal orijinlidirler. Şöyle ki, P. aeruginosa 'nın aeruginocini (pyocin) kromozomal genler tarafından spesifiye edilirler.

Bakteriyosinler proteazlar tarafından inaktive edilirler. Bazılarının morfolojileri de, elektron mikroskopla yapılan muayenelerde, faj kuyruklarına benzediği açıklanmıştır.

Kolisinlerin ve diğer bakteriyosinlerin molekül ağrılıkları 12000-90000 arasında değişmektedir. Kolisinlerin bazıları iki asimetrik protein molekülü olarak sentezlenir. Bunlardan büyük olanı, duyarlı bakteriyi öldürür ve küçük alt ünite ise kolisin immunite proteini aktivitesi gösterir. Bu alt ünite, kolisinin, in vitro, etkisini inhibe etmesine karşın, büyük alt ünitenin bakteriyi öldürmesine mani olacak etkinlikte değildir. İmmunite proteini kolisine sıkıca bağlanır.

Gram pozitif mikroorganizmaların plasmid orijinli bakteriyosinlerinin (streptococcin, staphylococcin, lactocin, vs) molekül ağırlıkları 10000-25000 arasındadır ve yapılarında lipid ve karbonhidratlar bulunmaktadır. Bu duruma göre lipoprotein veya glikoprotein özelliği taşımaktadırlar.

Kolisinler bazı antibiyotiklerden (Streptomycin, chloramphenicol) daha büyük molekül ağarlığına sahiptirler. Böyle büyük moleküllerin bakterilerin hücre duvarından içeri girmeleri oldukça zordur. Ancak, bakteriyosinler bir çok tarzda hedef bakteriyi etkileyerek lize ederler. Kolisinlerin hücre membranına bağlı enzimleri aktive ederek veya bazıları da hücre membranından içeri girerek, DNA ve RNA'ların fonksiyonlarını bozarlar. Kolisinler, daha ziyade, RNase ve DNase gibi etkinlik gösterirler. Bazıları da hücre membranının permeabilitesini artırır ve böylece kolisinlerin geçişini kolaylaştırır. Buna bağlı olarak diğer moleküllerin içeri ve dışarı akışı hızlanır ve hücrenin ortamdaki metabolik dengesi bozulur. Kolisinler, aynı zamanda, bakteri hücre membranında bulunan kolisin reseptörlerine tutunarak etkili olabilmektedirler. Colicin-B, E, K ve -M reseptörleri, ferri enterocholin, Vit B12, nukleosid ve ferrichrome (sıra ile) moleküllerinin hücreye girişinde rol oynarlar. Kolisin reseptörleri kolisinin aktivitesi için önemlidir. Eğer hücre duvarı ve buna bağlı reseptörler giderilirse, orijinal hücre kolisine rezistans olsa bile, elde edilen sferoplastlar duyarlılık gösterirler.

Ekseri kolisinler (Colicin A, -E1, Ia, Ib, -K) hücre duvarını kanallar oluşturarak, iyonların kolayca girip-çıkışına permeable hale getirir. Kolisinle muamele edilmiş hücrelerden genellikle potasyum (K+) iyonları fazla miktarda dışarı çıkar. Colicin E1 ve -K, hücrelerdeki ATP'ye bağlı reaksiyonları inhibe ederler (protein ve nukleik asit sentezleri de dahil). Katyonların hücreden çıkışı, bunların kofaktör olarak rollerine de mani olduğundan enzimlerin aktivitesini de inhibe eder.

Colicin E2 ile muamele edilen hücrelerin DNA'ları parçalanır. Ayrıca, Colicin E2 ile temas eden hücrelerde (bakterilerde) 16SrRNA'nın 3-terminusundan 50 nukleotidin çıkmasına neden olur ve bu RNA etkisiz hale gelir. Cloacid DF13'de (E. cloacae DF13 tarafından sentez edilir) benzer tarzda etkiye sahiptir. Bu kolisinlerin pürifiye formları in vitro olarak nuklease aktivitesi gösterirler. Col El, -A, Ia, ve Ib, hücre membranında depolarizasyon meydana getirerek bakteriyi öldürürler. Col E2 ve -E3'ün de DNase aktivitesi bulunmaktadır. Col -M ve Pesticin (Y. pestis tarafından sentezlenir), hücre duvarında ayrışmalar oluşturarak mikroorganizmaları lize eder. Pesticin, hücre duvarındaki NAGA ve NAMA molekülleri arasındaki beta-1,4 bağlarını koparır.

Kolisinleri spesifiye eden plasmidler başlıca iki gruba ayrılmaktadırlar. Grup I Col plasmidleri nonkonjugatif bir karakter taşımakta ve MA. 5x106 kadardır (Col El-K30, ve Clo DF13, vs). Grup II Col plasmidleri ise konjugatif olup MA: 50-80 x 106 civarındadır. Bazıları birden fazla kolisin sentezi için genetik informasyonlara sahiptir. Bunlar aynı zamanda ilaçlara dirençlilik genleri de taşımaktadırlar (Col V, ve Col B, F pilusu oluştururlar).

E. coli kültürlerinde, yaklaşık %0.1 bakteri Col+ bir özellik taşımaktadır. Kolisin sentezi ancak bir kaç saat sürer. Bazı kolisinlerin de kendi bakterisine etkiledikleri açıklanmıştır.

Bakterilerde, konjugasyon için pilus formasyonunu kodlamayan nonkonjugatif karakterdeki kolisin plasmidleri, eğer konakçı bakteri Col I gibi I pilus oluşturan bir plasmidle super infekte olduklarında, konjugatif plasmid kendi DNA'sı yanı sıra, diğer plasmidlerin de transferini ve hatta, kendi konakçısının DNA'sını da aktarabilir.

F piluslarını adsorbe eden fajlarla, I piluslarına bağlanan fajlar (Ifl) farklıdırlar. I pilusları, Col+ bakteri ile Col I- E. coli 'ler arasındaki konjugasyonlarda Col I faktörü alıcıya aktarabilir.

Kolisinojenik plasmidler, bakteri içinde bağımsız olarak replike olabilir ve konakçısı için de zararlı bir etkiye sahip değildir. Yani sentezlediği kolisinden konakçısı genellikle etkilenmez. UV-ışınları ve mitomycin C ile bazı kolisinojenik faktörler (plasmidler), indüklenebilirler.

Başlangıçta (orijinalinde) Col plasmidi taşımayan ve nonkolisinojenik olan bir bakteri, bu faktörü sonradan alarak Col+ hale gelebilir.

E. coli 'lerin kolisinojenik olup-olmadıklarını belirlemek için pratikte kullanılan bazı teknikler bulunmaktadır. Bunlardan birisi de "makrokoloni" yöntemidir. Bu teknik kısaca şöyledir:

Taze E. coli buyyon kültürü, agar besi yerinin ortasına, 1 cm çapında yer kaplayacak tarzda ekilir. Uygun bir ısıda (37°C) 48 saat inkube edildikten sonra, kültürün kapağına 1 ml kloroform konarak petri kutusu tersine çevrilir ve böylece 30 dakika kadar bekletilir. Petri kutusunun kapağı açılarak kloroformun uçması beklenir (15. dakika). Bundan sonra, bütün kolisinlere duyarlı olan E. coli K suşunun 24 saatlik buyyon kültüründen 1/100 sulandırılarak bundan petri kutusunu ortasındaki kültüre kadar gelmemek kaydıyla ekim yapılır ve 37°C 'de 24 saat inkube edilir. Ekilen suşun ürememesi kolisinin varlığını ortaya koyar. Ekilen suşun, daha ziyade ortadaki büyük koloniye yakın bölgelerinde inhibisyon oluşur.

Aşağıda bazı önemli bakteriyosinler ve bunları sentezleyen mikroorganizmalar gösterilmiştir. Ancak bunların hepsi plasmid orijinli olmayıp bazıları kromozomaldır.

A) Gram negatif mikroorganizmalar

Aerosin (A. aerogenes), Alveisin (B. alvei), Kloasin (E. cloacae), Kolisin (E. coli) Pestisin (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis) Piyoin (P. aeruginosa)

B) Gram pozitif mikroorganizmalar

Stafilokoksin (Staphylococcus), Streptokoksin (Streptococcus), Subtilisin (B. subtilis), Seresin (B. cereus), Monosin (L. monocytogenes), Megasin (B. megaterium)

Kolisin grupları ve bazı kolisinler

Grup A(I): E, E1, E2, E3, K, L, N, S4, X

Grup B (II): B, D, G, H, I, M,S, V,Q

12.4. Virulens Plasmidleri

Patojenik mikroorganizmalar, kendilerinde bulunan bazı virulens faktörleri (bunlardan biri veya birkaçı ile birlikte) ile konakçıyı hastalandırırlar ve hatta ölümlerine neden olabilirler. Ancak, bu etkinlikleri, virulent bakterinin konakçıya yeterince ve uygun yoldan girmesi ve konakçının genetik ve/veya immunolojik yönden (spesifik antikor taşımaması) duyarlı olması ile yakından ilişkilidir. Bakteri, ne kadar virulent olursa olsun, eğer konakçı buna direnç gösteriyorsa, mikroorganizma üreyemez, infeksiyon veya hastalık oluşturamaz.

Bakterilerin sahip oldukları virulens faktörlerinin bir kısmı da kromozomlarında kodlanmasına karşın bazıları da plasmid orijinlidir. Plasmidlerce kodlanan başlıca virulens faktörleri hakkında aşağıda kısa özlü bilgiler verilmektedir.

C. tetani (nörotoksin), B. anthracis (pOX1 letal toksin ve pOX2 kapsül formasyonu), B. thuringiensis (kristal toksin, insekt larvaları için toksik) A. tumefaciens (Ti plasmidi, dikotiledon bitkilerde tümör formasyonu), L. lactis (nisin), S. aureus (eksfoliatif toksin), Y. pestis, Y. psedotuberculosis, Y. enterocolitica (membran proteinlerini kodlayan plasmidler). S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae (dizanteri oluşturan toksinlerin kodlarını taşıyan plasmidler), insanlardan izole edilen E. coli 'lerde LT ve ST-toksinlerin sentezlerini spesifiye eden plasmidler (CFA-1, -2, E8775), buzağı ve kuzularda hastalık oluşturan E. coli 'lere ait K99 antijenleri ile domuz ishallerinden ayrılan E. coli 'ler de bulunan K88 ve 987 antijenleri plasmidler tarafından kodlanmaktadırlar.

Bazı virulens faktörleri de kromozomal orijinli oldukları gibi bir kısmı da fajlarla spesifiye edilirler. Örn, C. diphtheriae 'ye ait beta fajının kodladığı difteri toksini veya C. botulinum C 'de bulunan fajda aynı tarzda toksin sentezini spesifiye eder.

12.5. Metabolik Plasmidler

Metabolik aktivite bir çok bakteride kromozomlarda bulunan özel genler tarafından yönetilirler. Ancak, bazı bakterilerde de metabolizma ile ilgili reaksiyonlar hem kromozomal ve/veya hem de plasmid orijinli olabilmektedir.

1) Degradatif plasmidler: P. putida ve diğer pseudomonaslarda bir çok kimyasal maddeyi ayrıştırabilecek plasmid kaynaklı enzimlere sahiptirler. Böyle enzimlerin sayısı 10'dan fazlayı bulmaktadır. Örn., SAL, NAH, ASL ve TOL plasmidleri, sıra ile salycylate, naphtalene, alkyl benzen sulphonate ve tolueni ayrıştırarak catechola çevrilir ve sonra da plasmidlerce kodlanan enzimler tarafından acetaldehyde ve piruvatlara dönüştürülür.

Degradatif plasmidler konjugatif bir özellikte olup molekül ağırlıkları oldukça yüksektir (50-200 x 106). Bu plasmidler, genellikle, kompatible bir karaktere sahiptirler ve büyük plasmidler arasındadırlar.

TOL, SAL, OCT ve NIC plasmidleri de iki veya daha fazla farklı küçük plasmide ayrılabilirler ve bunlar bağımsız replikasyon orijinine sahip olduklarından da, transfer edildiklerinde hücre içinde serbest replike olabilirler. Ancak, bunlar, nonkonjugatif bir özellik gösterirler.

TOL ve NAH gibi plasmidler de geniş bir konakçı spektrumuna sahiptirler ve E. coli 'lere ve pseudomonaslara transfer edilebilirler.

2) Diğer metabolik plasmidler: Salmonellalar, genellikle, Lac-'dirler. Bazen Lac+ fenotipe dönüşebilirler (S. typhi). Bunları, Lac+ plasmidler gerçekleştirirler. Lac+ plasmidlere, salmonellalar dışında, serratia, S. lactis ve proteuslarda da tesadüf edilmiştir. Plasmidler, aynı zamanda, salmonellalarda, sukroz fermentasyonuna da neden olabilirler.

E. coli 'lerde K88 antijenlerini kodlayan plasmidler, aynı zamanda, rafinozun fermentasyonuna da sebep olurlar. Bazı raf + plasmidler de H2S üretimini de bakterilere kazandırabilirler.  

Plasmid SCP1 (Streptomyces coelicolor), methylenomycin sentezini kodlayabilmektedir. Kasugamycin ve chloramphenicol da plasmidler tarafından spesifiye edilirler.

Rizobiumlarda bulunan plasmidler de legumine bitki köklerine nitrojen fikzasyonunda etkin fonksiyonlara sahiptirler.

12.6. Büyük Plasmidler

Patojenik ve nonpatojenik bakterilerde molekül ağırlıkları 1-600 magadalton (Md) arasında değişebilen plasmidlerin varlığı belirlenmiş, bunların bir kısmının da moleküler yapıları ve kodladıkları spesifik proteinlerin karakterleri saptanmıştır. Genel bir kural olmamakla beraber, molekül ağırlığı 50 Md'den fazla olanlar "büyük plasmidler" olarak dikkate alınmaktadırlar.

Taşıdıkları çok değişik ve spesifik markerler yanı sıra, rekombinant DNA teknolojisinde de, özellikle, gen aktarmalarında önemli fonksiyonları olan plasmidlere, daha ziyade kirli ve organik materyallerden zengin sularda yaşayan bakterilerde rastlanılmaktadır.

Bakterilerin tek ve aynı zamanda küçük kromozoma sahip olmaları bunların genetik potansiyellerini ve diğer bazı fonksiyonlarını, ökaryotiklere oranla, daha kısıtlamaktadır. Ancak, bakteri genomlarında meydana gelen çeşitli mutasyonlar ve buna ilaveten, bakterilerde bulunan ve çok değişik karakterler taşıyan büyük plasmidler, fajlar, transposon ve İs elementleri, bakterilere yeni sekanslar, genler ve bunlara bağlı olarak yeni özellikler kazandırmaktadırlar. Fakat, bu genlerin bazıları, fazla sayıda meydana gelen replikasyonlar sırasında veya indüktörlerin etkisi altında, bakterilerden ayrılmakta ve mikroorganizmalar orijinal parental fenotipik karakterlerine tekrar dönmektedirler.

Bakteri kromozomunun %3-5'i uzunluğuna kadar ulaşabilen büyük plasmidler, hücre içinde, genellikle, küçük plasmidlere oranla daha az sayıdadırlar (1-5 adet). Kointegrasyon sonunda  sayıları daha da azalmaktadır. Plasmidler, hücre içinde ya bağımsız replikonlar halinde bulunurlar veya birbirleriyle birleşerek (kointegrasyon) büyük plasmidleri meydana getirirler. Ancak, bunun anlamı, her zaman böyle olur manasını taşımaz. Bazen de, tersi olabilmektedir. Yani, büyük plasmidler, daha küçük replikonlara ayrılmaktadırlar. Kointegrasyon sonucu oluşan multimerik plasmidler etkinlik bakımından diğerlerine oranla daha fazla avantajlıdırlar. Hatta, bazılarında da, birden fazla replikasyon orijini bulunmaktadır. Ancak, replikasyonda sadece bunlardan biri fonksiyonel olmaktadır.

Bakteri sitoplasmasında bağımsız bir replikon olarak bulunan plasmidler, genomla da birleşebilirler ve bunun bir devamı haline gelebilirler.

Bazı durumlarda da plasmidlerle kromozom arasında biyokimyasal yönden bir işbirliği de gelişmektedir. Şöyle ki, bir kimyasal maddenin metabolize olmasında önce kromozom (veya plasmid) etkinlik göstermekte ve oluşan ürünler de plasmid (veya kromozom) tarafından son ürünlere kadar ayrıştırılmaktadır. Örn, P. putida da bulanan CAM (campher) plasmidi (200 Md), campherin ayrışmasının bir bölümünü, bakteri kromozomu da geri kalan kısmını tamamlar. P. oleovorans 'da bulunan OCT (octane) plasmidi (200 Md), alkanları kullanma kapasitesini spesifiye eder. Ancak, tam olarak, alkanları yağ asitlerine kadar ayrıştıramaz. İlk basamakta, alkane oksidasyonu plasmid tarafından yönetilir. İkinci aşamada ise, alkol dehidrasyonu, bağımsız olarak hem plasmid ve hem de kromozom tarafından spesifiye edilir. Agrobacterium tumefaciens, ornitini iki ayrı basamakta ayrıştırır. Bunlardan biri pTiC58 plasmidinde kodlanmıştır ve diğeri ise kromozomal orijinlidir. Kromozom-plasmid işbirliğine (interaksiyon) TOL (toluene) plasmidinde de rastlanılmıştır.

Bazı durumlarda da işbirliği ters veya olumsuz bir yönde gelişebilmektedir. Şöyle ki, Rhizobium leguminosarum (sym plasmidi, pRIJI) ve R. trifoli 'de (pRtr5a) bulunan plasmidler, bakterilerin bakteriosin sentezlerini inhibe ederler.

Aynı fonksiyona sahip plasmidlerin molekül ağırlıkları, değişik bakterilerde, farklı ölçülerde olabilmektedir. Örn, E. coli 'de laktoz fermantasyonu 58.5 Md'luk plasmid tarafından yönetilmesine karşın, K. pneumoniae 'de 163 Md'luk plasmid aynı fonksiyonu yapar. R. leguminosarum 'da bulunan 100 Md'luk plasmid, hidrogenase aktivitesini spesifiye etmesine karşın A. eutrophus 'da 300 Md'luk plasmid aynı aktiviteyi iki enzimle yapar.

Bezende, aynı aktivite, aynı tür içindeki suşlar arasında değişik molekül ağırlığındaki plasmidler tarafından, spesifiye edilebilmektedir. Örn, B. thuringiensis suşlarında insektisidal delta tonsinini kodlayan plasmidlerin molekül ağırlıkları 44;50 ve 75 Md arasında bulunmaktadır. Halobacterium suşları arasında da gaz vakuollerini kodlayan plasmidlerin molekül ağırlıkları 44 ve 100 Md' arasıdır.

Kromozomla birleşen plasmidler bazı nedenlerle genomdan ayrılabilir ve ayrılırken de kromozomdan bir segment alabilirler. Böyle plasmidler de sitoplasmada sirküler forma dönüştürülerek bağımsız olarak kalabilecekleri gibi konakçıdan da çıkabilirler.

Bazı plasmidler de bir bakteride tek bir ünite halinde bulunduğu halde, diğer bir bakteri de iki plasmid halinde olabilmektedir. Örn, E. coli 'deki RI ve NR1 plasmidleri, P. mirabilis'e transfer edilirse küçük replikonlara ayrılmaktadır. P. rettgeri 'den izole edilen R plasmidi 'R 394, 115 Md) iki plasmide ayrılabilmektedir (11 ve 102 Md). Bunlardan her biri ayrı bir rezistanslık genini kodlarlar.

E. coli 'de bulunan R plasmidi tek bir ünite halinde ancak  iki kısımdan oluşmakta (RF ve TF).  Proteus veya salmonellalar da iki replikona ayrılabilmektedir.

P. mirabilis 'teki rezistenslik plasmidi (NRI) kloramfenikollu ortamda üretilirse, NR1'in büyüklüğünde ve r-determinant sayısında artmalar meydana gelmektedir. Benzer olguya, tetrasiklin plasmidine sahip olan S. faecalis 'te de rastlanılmıştır.

Bakteri içinde iken inkompatible olan iki plasmid, birleştiklerinde (kointegrasyon)  bir arada uzun sürü bulunabilmektedirler. Örn, UV-ışınları ve uygun seleksiyon yöntemleri CAM ve OCT plasmidlerini kointegre hale getirebilmektedir.

Kointegrasyon aynı zamanda, nontransmissible (nonkonjugatif) olan plasmidlerin mobilizasyonuna yardımcı olduğu gibi, bazılarının da kromozomla birleşmesine veya genomdan ayrılmasına da yol açabilmektedir.

İn vitro hazırlanan plasmidler, (suni plasmidler) bakterilere aktarıldıktan sonra hücre içinde bazı yapısal değişikliklere maruz kalmaktadırlar.

13. Antimikrobiyallere ve Metallere Dirençlilikte Plasmidlerin Rolü

Bakterilerde bulunan plasmidler kendi konakçılarını, bir çok tarzda, çeşitli antimikrobiyallere karşı dirençli hale getirebilirler. Plasmidler aracılığı ile gerçekleştirilen rezistenslik mekanizması başlıca 4 temel grupta toplanabilir.

1) Antibiyotiklerin etkilediği hedef bölgelerin modifikasyonu,

2) Antibiyotikler modifiye edilerek etkinliğinin inaktivasyonu,

3) Antibiyotiklerin hücreye girişinin önlenmesi

4) Enzim substitusyonu

13.1 Hedef Bölgenin Modifikasyonu

Stafilokok ve streptokok türlerinde bulunan plasmidlerin kodladığı enzimler, bakteriyel ribosomlardaki 23S rRNA da bulunan iki adenin molekülünü metile ederek, lincomycin ve erythromycinin bunlara bağlanmasını önlerler. Erythromycini sentezleyen Streptomyces erythreus'un 23 S rRNA'sı dimetile olduğundan, kendinin  sentezlediği antibiyotikten etkilenmez.

13.2. Antibiyotiklerin Modifikasyonu

Bazı Gram pozitif ve negatif mikroorganizmalarda bulunan plasmidlerce kodlanan kloramfenikol asetiltransferase enzimi, kloramfenikolu detoksifiye ederek (3-acetoxychloramphenical formasyonunun katalizasyonu) antibiyotik etkinliğinin inaktivasyonuna sebep olur.

Bu tarzda etkileyen birçok enzim elde edilmiş ve amino asit sekansları da saptanmıştır. Gram pozitif ve negatifler tarafından sentezlenen enzimler arasında bir yakınlık vardır. Kloramfenikol asetiltransferase intrasellüler bir enzimdir. E. coli 'de yapısal bir özellik taşıyan enzim, S. aureus 'ta indüklenebilir niteliktedir.

S. aureus 'un birçok suşları penicilin G'ye ve cephalosporine karşı gösterdiği dirençlilik, bu mikroorganizmalarda bulunan plasmidlerin kodladığı beta-lactamase (penicillinase) enziminin, antibiyotiklerin yapısındaki beta-laktam halkasını hidrolize ederek ayrıştırması ve buna bağlı olarak penisilinin etkinliğinin inaktive olmasındandır. Beta-lactamase enzimi aynı zamanda bazı Gram negatif ve pozitif diğer bazı mikroplar tarafından da sentezlenir. Ancak, bunların bazıları kromozomal orijinli ve bir kısmı da plasmidlerce spesifiye edilirler. Bazı suşlarda da her iki tarzda enzim sentezine rastlanmaktadır. Gram pozitiflerce  oluşturulan beta-lactamase ekseriye ekstrasellüler ve indüklenebilir bir özelliktedir.

Aminoglikozidlere (streptomycin, spectinomycin, kanamycin, gentamycin, amikacin) karşı dirençlilikler de plasmidler tarafından spesifiye edilen ve antibiyotikleri modifiye eden özel enzimlerin rolü fazladır. Modifiye olan antibiyotikler ribosomlara bağlanamazlar. Aminoglikozidleri modifiye eden plasmid orijinli ezimlere, Gram negatif ve  pozitif mikroorganizmalarda da rastlanmaktadır. Bunlar, N-asetilasyon, O-fosforilasyon ve O-nukleotidilasyon meydana getirirler. Asetilasyon yapan enzimler, kofaktör olarak asetil koenzim A'yı, fosforilasyon ve nukleotidilasyon yapan enzimler de ATP'yi veya diğer nukleotidleri substrat olarak kullanırlar. Bu enzimlerin katalize ettikleri reaksiyonlar, aminoglikozidlerde bulunan birçok amino veya hidroksil grupların birinde meydana gelebilir. Şimdiye dek 12 kadar farklı etkide enzim saptanmıştır. Bu enzimler, Gram negatiflerin hücre duvarlarında bulunurlar.

13.3. Antibiyotiklerin Girişinin Önlenmesi

Enterobakterilerde rastlanan Tn10 (Transposon 10) tetrasiklinlere dirençlilikte önemli fonksiyona sahiptir. Plasmidlerin sağladığı rezistenslikte tetrasiklinlerin hücreye girişi önlenir ve dışarı atılır.

13.4. Enzim Substitusyonu

Sulfonamidler, dihidroptoreate sentezinde fonksiyonu olan enzimin kompetatif inhibitörleridirler. Bu enzim (dihidroptoreate sentase), dihidrofolatın sentezi için gereklidir. Bazı Gram negatiflerde bulunan plasmidler, dihidrofolate sentase enziminin kodlarına sahiptirler. Ancak, plasmidlerin spesifiye ettikleri bu enzim sulfonamidlere, parental enzimden, 1000 defa daha az duyarlıdır. Böylece, sulfonamidlerden pek fazla etkilenmez ve bakterileri de bu antimikrobial ajanın etkisinden korurlar.

Trimethoprimler de, folate metabolizmasında rolü olan diğer bir enzimi, dihidrofolate reduktazın aktivitesini inhibe ederler. Gram negatiflerde bulunan plasmidlerin kodladığı dihidrofolate reduktase enzimi, kromozomal olan enzimden, 20000 defa daha fazla trimethoprime dirençlidir. Plasmidlerin kodladığı enzimin molekül ağırlığı 35 000 olmasına karşın E. coli 'nin kromozomal orijinli olan aynı enziminki ise 20 000 civarındadır.

13.5. Metallere Dirençlilik

Enterobakterilerde ve stafilokoklarda bazı metal iyonlarına karşı dirençlilik, plasmidlerce kodlanan özel genler tarafından sağlanmaktadır. Enterobakterilerdeki plasmidler, arsenik, gümüş, bakır, cıva ve tellurium iyonlarına, stafilokoklardaki plasmidler, arsenik, bizmut, kadmium, bakır, kurşun, civa ve çinko bileşiklerine, Pseudomonaslardaki plasmidler de krom, civa ve tellurium iyonlarına karşı dirençlilik mekanizması oluştururlar. Bazı iyonlara, özellikle Hg++, Ag+ veya TeO2 karşı rezistenslik, plasmidler sayesinde 100 kat daha fazla artar.

Enterobakterilerdeki konjugatif R plasmidlerinin %25'inde ve Pseudomonas aeruginosa 'daki R plasmidlerinin de %75'inde civa (Hg++) iyonlarına karşı dirençlilik genleri vardır. Bu bakterilerde bulunan ve plasmidlerce kodlanan redüktase enzimi Hg++ 'yı volatile HgO haline redükte eder ve etkisini giderir. Suda erimeyen ve uçucu olan volatile Hg, civaya dirençli bir bakteri sıvı kültüründen kolayca dışarı çıkabilir.

Tn501, bakterileri civa iyonlarına dirençli hale getirir. Kadmium ve arsenatlara karşı da plasmidlerce tayin edilen bir "dışarı itiş" mekanizması vardır.

Gümüş nitrat tedavisi görenlerden izole edilen enterobakterilerde ve P. aeruginosa 'da, veya diyetlerine büyüme promotoru olarak bakır katılan hayvanlardan izole edilen enterobakterilerde bu maddelere karşı dirençlilikte rolleri olan plasmidler saptanmıştır.

14. Rekombinant  DNA  Teknolojisinde  Plasmidler

Son yıllarda, plasmidler, genleri, veya DNA sekanslarını klonlamada aracı molekül (vektör) olarak çok fazla kullanılmaktadırlar. Çok sayıda,  ucuz ve kolay elde edilmeleri, çift iplikçikli, sarmal, sirküler veya lineer olmaları, yapılarında seleksiyonda önemli olabilecek bazı spesifik markerlerin (Ampr, Tetr, Kanr, Lac, vs) bulunması, belli uzunluktaki yabancı genleri kabul etmeleri, infeksiyöz olmamaları, replikasyon orijinlerine sahip olmaları, bazı restriksiyon enzimleri için kendilerinde sadece bir kesim yerinin bulunması, hücre içinde bağımsız replike olabilmeleri, alıcı hücrelere kolayca transfer edilebilmeleri ve bunun gibi diğer avantajları nedeniyle plasmidler vektör olarak fazla yararlanılan bir molekül haline gelmiştir.

Plasmidlerin DNA'larında bulunan markerler, bunların hücre içindeki replikasyonları için pek önemli değildirler. Bunlar olmadan da plasmidler bakteri içinde bağımsız olarak dublike olabilirler. Ancak, bunlar, taşıdıkları özel sekanslar nedeniyle konakçısına bazı önemli karakterler kazandırırlar. İşte plasmidlerde bulunan ve replikasyonunda gerek duyulmayan böyle bölgelere yabancı genler veya önemli bir proteinin kodlarını taşıyan sekanslar inserte edilebilir ve rekombinant plasmidler elde edilebilir (hibrid plasmid). Bu plasmid sonradan alıcı hücrelere (özellikle, E. coli, B. subtilis, vs) transfer edilerek aktarılan genlerin transkripsiyon ve translasyonu) sağlanır (ekspresyon).

Rekombinant plasmid elde ederken, plasmidde bulunan özel bir markerin (Ampr, Tetr, Lac, vs) içine inserte edilen yabancı gen, markerin bütünlüğünü bozduğundan, o genin inaktivasyonuna neden olur. Bu inaktivasyon, yabancı veya hedef genleri taşıyan bakteri kolonilerinin seleksiyonunda oldukça fazla yardımda bulunmaktadır. Buna karşın, diğer genler aktivitesini korurlar.

E. coli 'de klonlanan gen, burada iki tarzda bir işleme tabi tutulabilir. Bunlardan biri, genin ekspresyonu sağlanarak istenilen gen ürünü üretilebilir veya genin amplifikasyonu meydana gelerek çok sayıda gen elde edilir.

Plasmidlerin alıcı hücrelere transferinde ve/veya hücrede iyi bir ekspresyonunu sağlamada suni (yapay) plasmidlerden fazla yararlanılır. Bu amaçla, ekspresyon plasmidleri, ekskresyon plasmidleri, mekik vektörler, kosmid, faj mid, vs gibi prokaryotik ekspresyon vektörleri yanı sıra, plasmid tabanlı ökaryotik ekspresyon vektörleri de elde edilmiş ve başarı ile kullanılmıştır.

Son yıllarda özel antijen genleri taşıyan rekombinant plasmidler DNA aşılamalarında da kullanılmaktadırlar.

Vektörler hakkında ayrıntılı bilgiler "Mikrobiyolojide Biyoteknoloji" adlı bölüm de bildirilmiştir.

[1] Kaynak: Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 26462 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader