Vitamin Biotin Assay Broth

AOAC ve USP yönergelerine uygundur. İlaç, gıda, yem ve diğer pek çok sektörde In vitro (canlı hücre dışında) olarak, mikroorganizmalar kullanılarak vitamin miktarı tayininde kullanılılan sıvı besiyeridir.

Bazı bakteri türleri ve mayalar belirli vitaminlere karşı tam bağımlılık özelliği gösterirler. Bu mikroorganizmalar, (ihtiyaç duydukları vitamin hariç) gelişmeleri için gerekli olan bileşenlerin tamamını içeren bir besiyerine ilave edildiklerinde gelişmelerini tamamen durdururlar ya da hızla azaltırlar. İhtiyaç duydukları vitaminin ilave edilmesi ile mikroorganizmalar gelişmeye başlar ve bu gelişim, ilave edilen vitaminin konsantrasyonuna bağlı olarak değişir. Bu yönteme dayanarak bazı vitaminlerin konsantrasyonları, mikroorganizmalar kullanılarak, mikrobiyel gelişme sonucu oluşan bulanıklığın (türbidimetrik olarak) veya metabolitlerin (ör. laktik asit) (titrimetrik olarak) ölçülmesi ile kantitatif olarak belirlenebilir. Özelliği ve miktardaki bilinen saf vitaminin artan konsantrasyonları ile gerçekleştirilmiş paralel çalışmalar, bu vitamin için analiz standardını oluşturur.

Bileşimi

D(+) Glucose anhydrous 40 g/L; Casein hydrolysate "Vitamin-free" 12 g/L; DL-Alanine; L-Asparagine; L-Cysteinium chloride; L-Cysteine 200 mg/L; L-Tryptophane 100 mg/L; Adenine 20 mg/L; Guanosin 40 mg/L; Uracil 20 mg/L; Xanthine 10 mg/L; 4-Amino-benzoic acid 200 µg/L; L(+) Ascorbic acid; D(+) Biotin (Vitamin H); Calcium D(+) pantothenate 2 mg/L; Folic acid; Nicotin acid 2 mg/L; Pyridoxol hydrochloride 4 mg/L; Pyridoxamine hydrochloride; Riboflavin 2 mg/L; Thiaminium dichloride 2 mg/L; di-Potassium hydrogen phosphate 1 g/L; Iron(II) sulfate 20 mg/L; Potassium dihydrogen phosphate 1 g/L; Magnesium sulfate 400 mg/L; Manganese(II) sulfate 20 mg/L; tri-Sodium citrate dihydrate; Sodium acetate anhydrous 20 g/L; Sodium chloride 20 mg/L şeklindedir.

Hazırlanması

Dehidre besiyeri kısa süreli kaynatma ile 75,0 g/L olacak şekilde bidistile su içinde eritilir. Mikro-Inoculum Broth bileşimi, Proteose peptone 5,0 g/L; Yeast extract 20,0 g/L; D(+)glucose 10,0 g/L; Potassium dihydrogen phosphate 2,0 g/L; Tween 80 0,1 ml/L şeklindedir. 10 g Agar, Micro-Inoculum Broth'a ilave edilir ve otoklavda 121 ^oC'da 15 dakika sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası 25 ^oC'da pH'sı 6,8±0,1'dir.

Analiz Yöntemi

-Dehidre besiyeri 7,5 g / 100 mL olacak şekilde bidistile su içinde eritilir.

-Sık sık çalkalayarak 2-3 dakika gibi kısa süreli kaynatma uygulanır.

-Analiz edilecek örnek, dilüsyon serisi şeklinde tüplere konur ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır.

-Hazırlanmış bu tüplere 5'er mL besiyeri dağıtılır ve sterilize edilir.

-Soğutulmuş tüplere 1'er damla inokülasyon kültürü ilave edilir.

-37 ^oC'da 16-20 saat inkübasyona bırakılır.

-Oluşan bulanıklık 546 nm dalga boyunda fotometrik olarak ölçülür.

D-Biotin (Vitamin H) Testi

Örnek hazırlama: D-biotin miktarı önceden bilinen örnek (ör. ilaç sektörü), suda ısıtarak homojenize edilir. Eğer D-biotin miktarı bilinmeyen örnek analiz edilecekse ise öncelikle genel bir miktar belirlemesi yapılmalıdır. Bunun için, mümkünse, konsantre edilmiş ekstrakt hazırlanır ve 10'lu dilüsyon (seyreltme) serileri şeklinde analiz edilir. Biotin bağ oluşturmuş durumdaysa (ör. doğal sebze ürünleri) asit hidrolizi ile serbest hale getirilmelidir.

Asit hidrolizi: 1 g örnek 50 mL 1 N H₂SO₄ içerisinde homojenize edilir ve 121 ^oC'da 2 saat otoklavlanır. Soğutulduktan sonra pH 4,5'e ayarlanır. Santrifüj edilerek çözünmeyen maddelerin çökelmesi sağlanır ve üstte kalan sıvı kısım (süpernatant) pipet yardımı ile alınır. Analiz edilebilir konsantrasyona ulaşana kadar distile su ile seyreltilir. Biotini, hayvansal materyallerden ekstrakte edebilmek için 6 N H₂SO₄ kullanılacak ise otoklavlama süresi 121 ^oC'da 1 saat olarak ayarlanmalıdır.

İnokülasyon: Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) suşu Micro-Inoculum Broth'a ekilerek 37 ^oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır. Daha sonra kültür santrifüj edilir, fizyolojik tuzlu su ile 3 defa yıkanır ve mikrobiyel sayı 3 x 108 bakteri/mL olacak şekilde ayarlanır.

Kalibrasyon: D-biotin, buhar banyosunda ısıtılarak 100 mg/L olacak şekilde bidistile suda (içerik: 100 mcg/mL) eritilir ve 1 ng/mL'ye seyreltilerek referans çözelti hazırlanır. Bu çözeltiden 0,0-0,2-0,4-0,8-1,0-1,5-2,0-2,5-3,0 ng D-biotin/10 mL dilüsyon (seyreltme) serisi oluşturacak şekilde tüplere pipetlenir ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır. Kontrol tüplerine (kültür ve sterilite kontrolü için) sadece 5,0 mL damıtık su konulur.

Örnek: Analiz edilecek örnek çözelti, kalibrasyon aşamasındaki gibi dilüsyon (seyreltme) seriler şeklinde tüplere dağıtılır ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır.

Besiyeri hazırlama, inokülasyon: Dehidre Vitamin Biotin Assay Broth besiyeri kısa süreli kaynatma ile 75 g/L olacak şekilde bidistile suda eritilir. pH kontrol edilir ve gerekirse ayarlanır (25 ^oC'da pH'sı 6,8). Örnek ve referans çözelti dilüsyonlarını içeren tüm tüplere 5 mL kültür besiyeri kontrollü bir şekilde ilave edilir ve tüpler kapakları kapatılarak otoklavda 115 ^oC'da 10 dakika sterilize edilir. Soğutulmuş tüplere 1'er damla aşılama kültürü ilave edilir (sterilite kontrol tüpleri hariç). 37 ^oC'da 16-20 saat inkübasyona bırakılır.

Değerlendirme: Tüm tüpler fotometrik olarak 546 nm dalga boyunda incelenir ve optik bulanıklıkları (OD) ölçülür. Referans çözelti ile hazırlanmış tüplerden ölçülen bulanıklık değerleri standart madde miktarına karşılık gelecek şekilde bir grafiğe aktarılır ve kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Analiz edilen örnekteki biotin miktarı bu eğriye göre hesaplanır. Suya karşı kontrol kültürle yapılan okumalarda OD (546 nm, 1 c) < 0,150 olması durumunda analiz sonuçları anlamlı olmaktadır. Sterilite kontrol tüplerinde herhangi bir üreme (bulanıklık) olmamalıdır.

Kalite Kontrol

Ürün Bilgileri