Genler ve fonksiyonları

Genler  ve  Fonksiyonları

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1

  
01. Genlerin Yapısı 
01.01. Promoter (P) 
01.02. Operatör sekans (O) 
01.03. Lider sekans (L) 
01.04. Shine Dalgarno sekansı (SD) 
01.05. Enhenser 
01.06. AUG Kodonu 
01.07. Kodlayan Sekanslar (Ekson) 
01.08. Kodlamayan Sekanslar (İntron) 
01.09. Terminatör (T)  
02. Psödogenler   (Yalancı  Genler)
 
03. Gen Ekspresyonunun  Artırılması
 
03.01. Gen Sayısının Artırılması 
03.02. Gen Ekspresyonunun Artırılması  
04. Genlerin İnaktivasyonu
 
04.01. Mutasyonlarla İnaktivasyon 
04.02. Transpozonlarla İnaktivasyon 
04.03. Bakteriyofajlarla İnaktivasyon 
04.04. Antisens Oligonukleotidlerle Hedef  Genlerin İnaktivasyonu 
04.05. Ribozimlerle İnaktivasyon 
04.06. Rekombinant DNA Teknolojisi ile  İnaktivasyon 
04.07. Feedback Mekanizma İle İnaktivasyon  
05. Genlerin İzolasyonu  
06. Mikrosatelitler  (Minisatelitler)
 
07. DNA'da Tekrarlar ve  Sekonder Yapılar

01. Genlerin Yapısı

Genler, hücrelerin ve dolayısıyla da canlıların kalıtsal karakterlerinin, yaşamları için gerekli olan proteinlerin, enzimlerin, diğer makro- ve mikromoleküllerin kodlarını taşıyan, kromozom üzerinde lokalize olmuş, değişik uzunlukta (kodladığı proteinin büyüklüğüne göre) DNA sekanslarıdır. Genler, aynı zamanda, canlılardaki bütün, genetik, biyokimyasal, fizyolojik, vs. olayların denetimini, doğru yönde ilerlemesini de kontrol ederler. Bir kromozom üzerinde, prokaryotiklerde 2000-3000 ve ökaryotiklerde de 50.000-100 bin arası gen bulunmaktadır. Aşağıdaki tabloda bazı organizmalarda gen ve baz sayıları gösterilmiştir.

Genlerin kromozom üzerindeki sırası ve sayısı organizmalara göre belli bir düzen ve sıra içindedir. Bu uyum türler için sabittir ve değişmez. Ancak, cinsler veya familyalar arasında farklar gösterebilir. Bu düzenli sıralanış, bir tespih tanesine veya bir müzik kasetinde magnetik tape de bulunan ve ardışık yerleşmiş müzik parçalarına benzetilebilir.

Genlerin büyüklüğü de (baz sayısı) kodladığı proteinin büyüklüğüne göre değişebilir. Bu ölçü, 1500-2000'den 10000 bp'e kadar değişebilir.

Genler, nukleik asit sekanslarından oluşmakta ve belli özel peptidlerin bilgilerini kodlar halde taşımaktadırlar. Genleri oluşturan baz sıraları ve  sayıları da türler için de sabittir ve bu türlerin korunmasında çok önemli rollere sahiptir. Ancak, her amino asit'in spesifik bir veya birden fazla kodonla (triplet) belirlenmesi, bunların da 3'er tane nukleotid bazından oluşması, çok sayıda replikasyonların meydana gelmesi, polimerizasyon sırasında enzimlerin duyarlılıklarının azalması nedeniyle yanlış bazların sıraya girmesi veya mutasyonları indükleyici faktörlerin ortamda bulunması, vs. nedenler nadir de olsa (10-7-10-9 oranında) baz sıraları arasında bazı değişikliklerin oluşmasına yol açmakta ve mutasyonların gelişmesine neden olmaktadır. Böyle varyasyonların sonunda da parent hücrelerden farklı genotip ve fenotipte yeni nesiller (mutant) meydana gelmektedir. Bazı mutasyonların hafif veya belli-belirsiz olmasına karşın bir kısmı da öldürücü nitelik taşıyabilir.

Prokaryotiklerde nukleik asitteki baz sıraları ile kodlanan proteindeki amino asit sıraları arasında bir düzen ve uyum vardır ve kesintisizdirler (kolineer). Bakterilerde ve bakteriyel viruslarda, genler kesintisiz olarak birbiri arkasına sıralanmalarına karşın, ökaryotiklerde ve bazı viruslarda, genler içi ve genler arasında hiç kodlama yapmayan (noncoding) sekanslar bulunmaktadır. Bunlara genel olarak intron (intervening sequence) adı verilmektedir. Buna karşın kodlayan sekanslar da, ekson olarak tanımlanmaktadırlar. Böyle kodlamayan sekanslar hem genleri bölmekte ve hem de iki gen arasını açmaktadırlar. Örn., alfa kollagen geninin 50'ye yakın bölüme ayrıldığı belirtilmektedir. İntronların uzunlukları da değişik olmasına karşın 2-3 kb uzunluğa kadar olabildiği açıklanmıştır. Hatta, bazıları eksonlardan da daha uzun olduğu bildirilmiştir. Ökaryotiklerde, DNA üzerindeki böyle durumlar genlerin uzunluğu ile kodlanan proteinin uzunluğu arasında bir farkın meydana gelmesine de neden olmaktadır. Ancak, transkripsiyon sırasında pre mRNA da eksonlarla birlikte intronlar da bulunmasına karşın, bunun prosesi sonu sentezlenen olgun mRNA'da sadece eksonlar bulunur ve intronlar çıkarılır. Çekirdek içinde meydana gelen bu olgudan sonra, olgun mRNA çekirdek etrafındaki deliklerden geçerek sitoplazmaya girer ve burada ribosomlara yerleşerek translasyona tabi tutulur.

Ökaryotik  hücrede protein sentezi sırasında pre mRNA’da bulunan intronların çıkarılması ve eksonların birleştirilerek olgun mRNA’nın  meydana gelmesi yandaki şekilde gösterilmiştir.

Her ne kadar intronlar ökaryotiklerin DNA'larında görülüyorsa da, ökaryotiklerden olan mayaların genomundaki genlerin çoğu intronsuzdur.

İntronların çıkarılarak eksonların yan yana getirilip birleştirilmesi fenomeni hakkında çok fazla bilgi bulunmamakla beraber, araştırıcılar bazı görüşler ileri sürmektedirler. Şöyle ki, birleştirilmede snurpların (snRNA: small ribonucleoprotein particle) rolü üzerinde durulmaktadır. Bu substanslar nukleusda bulunur ve yapısında RNA ve proteinler vardır. Urasilden zengin olan snurpların ekson-intron kavşak yerleri için komplementer sekanslara sahip olduğu ve bu bölgeye kolayca tanıyarak bağlandığı, intronları hidrolize ederek çıkardığı ve eksonları birleştirdiği açıklanmaktadır.

Ökaryotiklerde intronlar her ne kadar kodlamayan sekanslar olmasına, yani herhangi bir spesifik proteinin kodlarını taşımıyor ve kodlamıyorsa da, regülatör bir fonksiyona sahip oldukları araştırıcılar tarafından belirtilmektedir. Ancak, bazı istisnalar da bulunmaktadır. Örn, mayalardaki mitokondrial DNA'daki intronların protein kodladığı ve bunun eksonların kodladığından bağımsız fonksiyona sahip olduğu bildirilmektedir. Çok nadir de olsa, bazı durumlarda, tek bir genin iki proteini kodlayabildiği açıklanmıştır. Bunun başlıca nedenlerinden birisinin transkripsiyonun farklı noktalardan başlaması olduğu belirtilmektedir. Ayrıca, iki genin aynı sekansı paylaşması durumları ortaya çıkmakta ve bunun da DNA'nın farklı şekilde okunmasından kaynaklandığı ileri sürülmektedir.

Ökaryotiklerde transkripsiyon sonucu sentezlenen tek iplikçik mRNA'lar posttranskripsiyonal proseslere ve translasyon sonucu meydana gelen proteinler de posttranslasyonal proseslere (işlemlere) tabi tutulurlar. mRNA'ların prosesinde, 5-' ucuna 7- metilguanosin ve 3'-ucuna da poliadenilatların (poli AA.....) ilavesi; intronların çıkarılması, eksonların yan yana getirilerek olgun mRNA'nın oluşturulması ve bunun translasyon için sitoplazmaya transferi; proteinlerin prosesinde ise sentezlenen proteinlerin katlanması, amino asitlerin kimyasal modifikasyonları, fosforilasyon, glikolizasyon, acylation, proteolitik ayrışmalar gibi işlemlere tabi tutulurlar.

Bir genin yapısında bulunan temel sekanslar yandaki şekilde gösterilmiştir.

01.01. Promoter (P)  

DNA’ya bağımlı RNA polimerase enziminin bağlandığı bölgedir. Buna ait yeterli bilgi sayfa 149'de verilmiştir. Ökaryotiklerde bu bölgede 3 önemli lokalizasyon bulunmaktadır. -90, -80 ve -30 bölgeleri en fazla korunan yerler arasındadır. Prokaryotiklerle aynı fonksiyona sahiptir (-35 ve -10 bölgeleri).

01.02. Operatör sekans (O) 

Bu bölgede represör ve aktivatörler etkinlik gösterir. Promoterin hemen sağında bulunur.

01.03. Lider sekans (L) 

mRNA'da transkripsiyonun başlama noktasından sola doğru (5' -terminusa doğru, upstream) yerleşmiş sekanslardır. Bu kısım ribosomlarda translasyona tabi tutulmaz. Uzunluğu prokaryotik ve ökaryotiklere göre, yaklaşık 20-100 baz kadar olan lider sekans, mesajın ribosomlara iyice bağlanmasında etkin role sahiptir. Prokaryotik ve ökaryotiklerde aynı fonksiyondadır.

01.04. Shine Dalgarno sekansı (SD) 

AUG kodonundan sola (5'-ucuna) doğru -7 bölgesinde bulunan polipürin karakterinde (AGGA GG) sekanslardır. Bu bölge, 16S rRNA'nın 5' -terminusu ile komplementerdir. Ribosomun mRNA'ya bağlanmasını sağlar. Prokaryotiklerde vardır ve mRNA'ya aktarılır.

01.05. Enhenser

Ökaryotiklerde bulunan bu sekansın transkripsiyonu stimule etme aktivitesi bulunmaktadır.

01.06. AUG Kodonu 

mRNA üzerinde, transkripsiyon için başlama sinyali veren ve formilize olmuş methioninin kodonudur. Buradan sağa doğru (3' -terminusa, down stream) polimerizasyon devam eder. AUG'nin transkripte edilen DNA sekansı (3' ¬ 5') üzerindeki tripleti TAC'dir. mRNA'ya aktarılır.

01.07. Kodlayan Sekanslar (Ekson) 

TAC  kodonundan itibaren sağa doğru polimeraz enziminin mRNA'yı sentezlediği ve genetik bilgilerin anlamlı DNA'dan mRNA'ya aktarıldığı bölgedir.

01.08. Kodlamayan Sekanslar (İntron) 

Bu sekanslar genler içinde ve genler arasında bulunabilir ve genlerin aralarını açarlar. Bunlar ökaryotiklerde ve bazı viruslar da vardır.

01.09. Terminatör (T) 

DNA üzerinde, RNA polimeraz enziminin transkripsiyonu durdurma sinyalini veren sekanstır. DNA'da bulunan terminasyon kodonları, ATC, ATT ve ACT olup, bunların mRNA daki tripleri ise UAG (amber), UAA (ochre) ve UGA, (opal) dır ve protein sentezini durdururlar. Bunlara aynı zamanda nonsense kodonlar da denir. mRNA'ya aktarılır.

Genlerin izolasyonları, çıkarılması, transferleri, klonlanması, ekspresyonları ve diğer aktiviteleri hakkında ilgili bahislerde yeterli bilgiler verilmektedir.

02. Psödogenler   (Yalancı  Genler) 

Psödogenler (yalancı genler), fonksiyonel genlerle ilişkisi olan, fakat bir aktif protein haline transle edilemeyen genler olarak tanımlanmaktadırlar. Bazı araştırıcılar da, böyle genleri, fonksiyonel olan genlerin etkinliği olmayan kopyası olarak kabul etmektedirler. Psödogenler genellikle y sembolü ile ifade edilirler.

Psödogenler, fonksiyonel genlerin genel yapısına benzer sekanslara (intron ve ekson) sahiptirler. Replikasyonun çeşitli aşamalarında meydana gelen spontan veya indükleyici etkenlerin etkisi ile oluşan mutasyonlar sonu inaktif hale gelmişlerdir. Örn., transkripsiyonun başlamasını veren sinyal bazlarında bozukluklar mRNA sentezini ve dolayısıyla da translasyonu olumsuz yönde etkiler ve bu önemli fonksiyonlar ortadan kalkarlar.

Psödogenlere bir çok protein genlerinde rastlanılmıştır. Örn., globin, immunglobulin ve histokompatibilite antijenleri genleri, vs.de böyle inaktif genlere sahiptirler. Bunun tipik örneği tavşanların psödogeni (ß2) olup, bu gen ekson ve intronlardan oluşmakta ve bu da yapısal olarak fonksiyonel aktif globin genine (ß1) çok benzemektedir.

RNA transkriptine (mRNA) benzeyen inaktif genomik sekanslara işlenmiş psödogen (processed pseudogene) adı verilmektedir.

İnaktif genler, yine çeşitli mutasyonlarla aktivite kazanabilirler.  

03. Gen Ekspresyonunun  Artırılması 

Hücrelerde gen sayısının ve gen ekspresyonunun arttırılması için değişik metotlar kullanılmaktadır. Bunlardan önemli olanlarından bazıları aşağıda bildirilmiştir.

03.01. Gen Sayısının Artırılması 

a) İstenilen bir ürünün veya proteinin sentezini kodlayan gen (hedef gen) kromozomdan uygun bir restriksiyon enzimi kullanılmak suretiyle kesilerek çıkarılır ve pürifiye edilir. Bu gen, hücre içinde çok fazla üreyebilen veya kopyası fazla olabilen bir plasmidin DNA'sı ile birleştirilir. Bu amaçla daha ziyade küçük suni plasmidler tercih edilirler. Çünkü, küçük plasmidlerin hücre içindeki kopya sayıları genellikle fazla olabilir. Bu rekombine plasmid alıcı bir hücreye transfer edilerek, genleri taşıyan plasmidlerin fazlaca üremesi sağlanır. Sonra bunlardan gen çıkarılır.  

b) Plasmid ile birleştirilen hedef gen, uygun bir alıcı bakteriye transfer edildikten sonra, bu konak bakteri, içinde 150 mg/ml Chloramphenicol bulunan besi yerine transfer edilir. Böyle bir ortamda mikroorganizma içinde plasmidin çok sayıda kopyası (bakteri başına 1000'den fazla) oluşur ve böylece gen sayısı da artmış olur. Ancak bu mikroorganizmada ekspresyon meydana gelmez. Çünkü antibiyotik protein sentezini inhibe eder buna karşın plasmidin sayıca artmasına mani olmaz.

c) Hedef genin baz sıraları iyice biliniyorsa, bu takdirde, laboratuvarda sentetizerler yardımı ile sentetik gen hazırlanabilir ve başarı ile kullanılabilirler.

d) Hedef gen taşıyan DNA (veya mRNA), in situ PCR yöntemi ile çoğaltılır ve bundan gen çıkarılarak kullanılır.

03.02. Gen Ekspresyonunun Artırılması 

Genin amplifikasyonu, her zaman, aynı genin ekspresyonu ile paralel gitmeyebilir. Gen ekspresyonunun istenilen düzeye çıkarılması için bazı yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar da özetle şöyledir.

a) Hücrelerde DNA'nın transkripsiyonunda önemli fonksiyonu olan RNA polimeraz enzimi promoter bölgesine bağlanarak, buradan itibaren 3' -ucuna doğru (downstream) transkripsiyonu gerçekleştirilir. Ancak, bu tarzdaki ekspresyon her zaman aynı kuvvette olmaz. Diğer bir ifade ile, eğer bir gen, bir hücrede yüksek düzeyde eksprese edilebiliyorsa (fazla ürün sentezi oluşuyorsa) kuvvetli promotere sahip olduğu düşünülür. Bu nedenle promoterin kuvvetli olması veya özel bir tarzda modifiye edilerek kuvvetlendirilmesi gereklidir.

b) Hücrelerde genin ekspresyonu da kontrol altına alınabilir ve regule edilebilir. Örn., E. coli 'de, aminoasitleri kodlayan genler, eğer bu aminoasitler hücrede çok fazla miktarda bulunuyorsa represe edilerek, yeniden aminoasit sentezi durdurulur (feedback inhibisyon). Bu fenomenin mekanizması kısaca şöyledir: Hücre içinde bulunan ve inaktif bir karakterde olan represör proteinlere gen ürününün bağlanması represör moleküllerini aktive ederek, promoter bölgesine bağlanmasına yol açar. Bu durumda RNA polimeraz enzimi promotere bağlanamadığından genin ekspresyonu da gerçekleşemez.

Feedback inhibisyonun ters mekanizmasını oluşturarak genin ekspresyonunu artırılabilir. Şöyle ki, eğer represör proteinlerin aktive olması önlenirse ve böylece de promotere bağlanması inhibe edilir ve bakteriler fazlaca gen ürünü eksprese edebilirler. Bunu sağlamak için de, promoter bölgesinde bulunan operatör sekanslarda bazı modifikasyonlar yaparak veya represör proteinleri kodlayan genlerde mutasyonlar meydana getirerek bu proteinlerin promotere bağlanması önlenebilir ve böylece genin ekspresyonu devam eder, kapanmaz.

Araştırıcılar, son yıllarda, genlerin fonksiyonları için gerekli olan promoter ve terminatör sekansları değiştirebilmekte ve yeni ortama adapte olabilecek ve iyi bir etkinlik gösterebilecek tarzda modifiye edilebilmekte ve düzenleyebilmektedirler. Yeni ortamda fonksiyonel olamayan bir gene ait promoter ve terminatör sekansları çıkararak, bunları transfer edilecek gende kullanmak suretiyle, bu yeni gene işlerlik kazandırmak olanak dahilindedir. Örn., tavuk yumurta albumin geni, yaprak protein genine ait kontrol sekanslara (promoter-terminatör) bağlandıktan sonra bir bitki hücresine (Örn., yonca) transfer edilirse, oluşturulan transgenik bitki (yonca) yapraklarında yumurta akı biriktirebilir. Bu durum meraların besleyici kapasitesini artırmada etkili olabilir. Böylece, bir bitki (transgenik bitki), solar enerjiden yararlanarak fotosentetik mekanizma ile tavuk yumurta akı proteinini üretebilir hale gelebilir.

Genlerde kontrol mekanizmasını sağlayan sekanslar (promoter ve terminatör) arasında da önemli farklar bulunmaktadır. Bazıları ne kadar protein sentezleneceğini, bir kısmı da genlerde hangi sinyallerin ve ne kadar respons göstereceğini ve kimileri de organizmanın neresinde fonksiyonel olacağını tayin ederler. Promoterler, sentezlenen proteinin miktarına göre zayıf, normal, kuvvetli (veya super promoter) olmak üzere gruplara ayrılmaktadırlar. Biyoteknolojik yöntemlerle, bilim adamları, zayıf veya normal promoterleri kuvvetli ile değiştirebilmekte ve genin etkinliğini artırabilmektedir. Bir türde etkin olan promoter, eğer geni ile birlikte başka bir organizmaya transfer edilirse bu yeni ortamda zayıf bir fonksiyon gösterebilir. Çünkü, yeni organizmanın replikasyon ve ekspresyon mekanizmaları bu yeni promoteri tam algılayamaz veya kabul edemez. Bu nedenle, promoterleri, yeni ortamın iyi tanıyabileceği başka bir promoterle değiştirilmesi gereklidir.

Memeli genlerinin, bakterilerde ekspresyonunda en fazla güçlük çekilen nokta, genlerin içinde ve genlerin aralarında bulunan ve bunları bölen ve herhangi bir kodlama yapmayan intronlardır. Bakterilerin ekspresyon mekanizmalarında intronları tanıyarak bunları çıkaracak mekanizmalar bulunmamaktadır. Onun için, intronlar önceden çıkarılarak sadece eksonlardan oluşan olgun mRNA hazırlamak ve bundan yararlanmak gerekecektir. Bakteriler aynı zamanda, bir amino asit için olan birden fazla tripletleri değerlendirmede ökaryotikler kadar organize olmadıkları gibi glikolizasyon reaksiyonlarına da sahip değildirler. Bu nedenle, memeli genleri taşıyan DNA sekanslarını ve kodonları, bakterilerin kolayca tanıyabileceği ve algılayabileceği bir tarzda değiştirmekte yarar vardır.

Bakteriler tarafından kabul edilen ve eksprese edilen genler, burada uzun süre kalabilmeli, en yüksek düzeyde eksprese edilebilmeli, gen aktivitesi kontrol edilebilmeli, sentezlenen gen ürünleri bakteri içinde ayrışmamalı ve kontamine olmamalıdır.  

04. Genlerin İnaktivasyonu 

Genetik manipulasyonlar arasında, sadece yeni genler transfer ederek değişik ve istenen karakterlere sahip organizmalar veya hücreler elde etmek değil, aynı zamanda, istenmeyen genlerin aktivitesini azaltmak veya inaktive ederek fonksiyonuna tamamıyla mani olmak gibi çalışmalar da bulunmaktadır. Genlerin kısmi veya tam inaktivasyonu üzerinde bir çok değerli çalışmalar yapılmıştır. Bunlara ait ve önemli olan bazı teknikler aşağıda bildirilmiştir.

1) Mutasyonlarla inaktivasyon  
2) Transpozonlarla inaktivasyon  
3) Bakteriyofajlarla inaktivasyon  
4) Antisens RNA ile inaktivasyon  
5) Ribozimlerle inaktivasyon  
6) Rekombinant DNA teknolojisi ile inaktivasyon  
7) Feedback mekanizma ile inaktivasyon  

04.01. Mutasyonlarla İnaktivasyon

Kromozomlar üzerinde ardışık olarak sıralanmış olan fonksiyonel genler (ancak, ökaryotiklerde genlerin bazıları intronlarla bölünmüştür), çeşitli iç ve dış nedenlerin (fiziksel, kimyasal, biyolojik, metabolik, fizyolojik mutajenik maddeler, vs.) etkisi altında gelişen mutasyonlara bağlı olarak, bazı değişikliklere (bazların girmesi, çıkması, karşılıklı bağlantıların değişmesi, vs.) maruz kalmaktadırlar. Genetik düzeyde oluşan ve özellikle, DNA'daki bazların diziliş sıralarını bozan böyle mutasyonlar organizmaların fenotiplerini değiştiren inaktivasyonlara yol açtığı gibi bazen de ölümlere de neden olabilmektedir. Mutasyonlar sonu parental organizmalardan farklı özellik gösteren mutantlar ortaya çıkmaktadır. Şöyle ki, parental organizma Lac+, Sac+ pozitif ise, mutasyonlar sonu Lac-, Sac- hale gelebilirler. Böylece, bu iki gen inaktive edilmiş veya etkinliği ortadan kaldırılmıştır.

Ancak, bazı durumlarda da gen fonksiyonunun ortadan kaldırılması arzu edilen bir durum olabilir. Şöyle ki, insan veya hayvanlarda hastalık oluşturan bir mikroorganizmadan patojeniteyi sağlayan virulens faktörlerinden bir veya birkaçı genetik manipulasyonlarla giderilebilir. Böylece, hastalık oluşturmayan mutant suşlar elde edilir ve bunlar aşı suşu olarak başarı ile kullanılabilirler.

04.02. Transpozonlarla İnaktivasyon

 Transpozonlar (Tn: kromozom veya plasmidlerin üzerinde bulunan ve yer değiştirebilen genetik elementler), yer değiştirirken önemli bir gene girebilmekte ve genin bütünlüğünü bozarak inaktivasyonuna neden olmaktadırlar. Ancak, kromozom üzerinde bu yer değiştirme işlemi genellikle kontrol altında tutulamadığından veya güvenilemediğinden, istenmeyen genlerin inaktivasyonunda pek kullanılmamaktadırlar. Bazen, kalması gereken ve çok önemli bir fonksiyona sahip genin içine de girerek onun aktivitesine son vermektedirler. Ayrıca, inaktive olan bir gen, sonradan transpozonun buradan ayrılması ile tekrar eski etkinliğine kavuşmaktadır.  

04.03. Bakteriyofajlarla İnaktivasyon 

Bazı fajlar, bakterilerde belli bir genin yanına yerleşmekte veya içine girebilmektedirler. Örn; E. coli 'ye ait olan Lambda fajı, genellikle, bu bakterinin galaktoz ile laktoz genleri arasına  integre olur. Faj, profaj halinde burada kalır ve nesillere böylece aktarılır. Eğer bakteri ultraviolet ışınlarına maruz bırakılırsa veya herhangi bir indükleyici etkenin tesirinde, bu faj aktive olur ve buradan ayrılarak kendi konakçısını lize edebilir. Ancak, faj bakteriden ayrılırken bazen galaktoz genini de buradan alabilir ve başka bir Gal- bakteriyi infekte ettiğinde onu pozitif (Gal+) hale getirebilir. Galaktoz geninin ayrıldığı E. coli 'de Gal- hale dönüşür.

Mu-fajı (mutator faj) da, bakteri kromozomu üzerinde yer değiştirdiğinden mutasyonu inaktivasyonlara neden olabilmektedir.  

04.04. Antisens Oligonukleotidlerle Hedef  Genlerin İnaktivasyonu

Son birkaç yıl içinde, antisens oligonukleotid (oligomerler) kullanılarak, istenmeyen (hedef) genlerin inaktivasyonlarını, malignant hücrelerin ve virusların in vivo ve/veya hücre içinde üremelerinin inhibisyonlarını sağlamak, çok fazla üzerinde çalışılan bir konu haline gelmiş bulunmaktadır. Henüz gelişme aşamasında olan, in vitro hücreler üzerindeki araştırmalardan tam olarak kurtarılıp in vivo denemelere geçilemeyen bu teknolojinin ilerde başarılı olacağına inanılmaktadır.

Bu gün hastalıkların önlenmesinde kullanılan ilaçların bir kısmı, hücre DNA'sı ile genellikle birleşmektedirler. Ancak, ilaçlar, spesifik nukleotid sekanslarını tanımadıkları için veya sınırlı bir tanıma yeteneğine sahip olduklarından özel genlerin ekspresyonlarına mani olamamaktadırlar. Antisens oligomerleri ise, hücrenin normal mRNA'sı üzerinde bulunan spesifik gen bölgelerine komplementer (veya anti paralel) olarak hazırlandıklarından bu sekanslara kolayca bağlanabilmekte ve mRNA'nın ve özellikle burada bulunan spesifik hedef bölgenin translasyonuna mani olmaktadırlar. Oligomerler, yaklaşık 10-30 bazdan oluşmuş sentetik oligonukleotidlerdir. Diğer bir ifade ile, hücre içinde mRNA üzerindeki hedef genlere (spesifik sekanslara) bağlanarak, bunların translasyonlarını önleyen tek iplikçik kısa sentetik antisens oligonukleotidlerdir. Bu tekniğin ilk doğal örneğine E.  coli 'de rastlanılmıştır.

Prokaryotik ve ökaryotiklerde çift iplikçikli olan DNA'dan mRNA'nın sentezinde RNA polimeraz enzimi (transkriptaz, DNA'ya bağımlı RNA polimeraz enzimi) kullanılır. Bu enzim, DNA'nın 3'¬¾¾5' yönünde olan iplikçiğini kalıp olarak kullanarak, bunun üzerinde olan genetik şifreleri aynen (ancak, timin yerine urasili koyarak) yeni sentezlenen mRNA'ya aktarır. Tek iplikçik olan bu normal  hücre mRNA'sı, kendine kalıp ödevi gören DNA iplikçiğine anti paraleldir (5'¾¾®3') ve aynı zamanda, komplementerdir. Bu durum aşağıdaki şekilde gösterilmiştir.

Sens Ve Antisens Baz Sıraları

Mesenjer RNA üzerinde bulunan hedef genlerin inaktivasyonunda genellikle iki tür strateji uygulanmaktadır. Bunlar da,

1) Hücrenin normal mRNA'sındaki hedef gen bölgesi içinde bulunan bazı spesifik sekanslara anti paralel (komplementer) olan ve aynı zamanda onlarla birleşebilen çok kısa tek iplikçik deoksiribonukleotid sekansları hazırlayarak hücrelere transfekte etmek. Bu oligomerlerin sentezinde DNA sentetizerler kullanılabilir. Eğer istenirse, PCR ile de sayıları istenilen düzeye çıkarılabilir. Bunların, hücrelere transfeksiyonunda bazı tekniklerden (CaPO4 ile presipitasyon, elektroporasyon, vs) yararlanılabilir. Hücreler içine giren bu antimesenger oligodeoksiribonukleotidler (30 bazlık), mRNA üzerindeki hedef gendeki özel bazlarla birleşerek kısa çift iplikçik (DNA - mRNA) hibrid molekül oluşturur. Bu dubleks sekans, ribosomlar tarafından deşifre edilemez ve kullanılamaz. Bu nedenle de hedef gen aktivitesini kaybeder.

Bu teknikte, hücre mRNA'sının yönü 5'¾¾¾®3' olduğundan, hazırlanan oligomerin yönü ise 3' ¬¾¾¾ 5' olması gereklidir.

Eğer, sentetik DNA sekansı, mRNA'nın başlangıç yerinden uzaktaki sekanslara karşı hazırlanmış ise, hızla devam eden translasyon sırasında bu dubleks çok kısa bölge atlanarak protein sentezi devam eder. Eğer, burada tümden protein sentezi sonlanırsa, hücrenin çok önemli olan genlerine ait ürünler sentezlenemez ve hücreler ölebilir.

Eğer, sentetik DNA sekansları mRNA'nın başlangıcındaki bazlara karşı hazırlanırsa, bu defa tüm mRNA ribozomlara bağlanmayabilir ve böylece translasyon da tümden inhibe edilebilir.

Bu teknikteki önemli nokta, sentetik DNA segmentlerinin hücre içindeki DNase enzimlerinin etkisi ile ayrıştırılmasıdır. Bunun da önlenmesi gerekir. Bu yönde alınan önlemlerin arasında modifiye edilmiş oligodeoksiribonukleotidlerin hazırlanması ve kullanılmasıdır. Böyle oligomerler de sentetizerler tarafından kolayca sentez edilebilmeleridir. Bu amaç için, fosforamid ve H-fosfonate kimyasından yararlanılmaktadır. Bunlar, hücrelere daha kolay girmekte ve ekzonukleaz ve endonukleazlardan da etkilenmemektedirler.

mRNA üzerinde bulunan spesifik sekanslar ile birleşen antisens oligomerler yandaki şekilde gösterilmiştir.

 

Antisens RNA teknolojisi yandaki şekilde gösterilmiştir.

Modifiye edilmiş oligomerlerin hücrelere giriş etkinliği, farmakokinetiği, doku içindeki dağılımı, toksisitesi, yan etkileri, hücre içinde veya doku içinde kendi formlarını koruyabilme durumları, etkinlik dereceleri, vs. diğer özellikle çok iyi saptanmalıdır. Bunların yanı sıra, antisens oligomerlerin selektivite (hedef genlerdeki spesifik sekansları tanıma ve bağlanma yeteneği), stabilite (hücre içinde nukleazlara direnç durumu), hücre içinde hedef sekanslara

  yeterli miktarda ve etkinlikte ulaşabilmeleri ve solubiliteleri (hücre membranlarından içeri kolayca girebilmeleri) ayrıntılı olarak incelenmelidir ve belirlenmelidir.

2) Diğer teknik de ise, sentetik olarak antisens genler hazırlamak, bunları mekik plasmid vektörlere bağlayarak hücrelere transfer etmek, hücre içinde ekspresyonlarını sağlamak, genin transkripsiyonunu sonucunda sentezlenen antisens tek iplikçik RNA'nın, hücre mRNA'sındaki hedef bölge ile birleşerek istenmeyen genin translasyonuna mani olmak, amaçlanır. Böylece oluşan dubleks RNA - RNA molekülü ribosomlar tarafında kullanılmaz ve genin aktivitesi ortadan kalkar. Bu tekniğin aşamaları özetle aşağıda gösterilmiştir:

a) Mesenger RNA'da bulunan hedef bölgenin spesifik sekanslarına karşı ve bununla birleşebilecek olan antisens RNA molekülünün sentezini sağlayacak DNA sekansları hazırlanır (tek iplikçik). Bu oligomer, hedef RNA'yı kodlayan DNA sekanslarının ters oriyentasyonu ile elde edilir.  

b) Sonra, bu tek iplikçik oligomer, çift iplikçikli hale getirilir.  

c) Bu suni gene, prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde aktivite gösterebilmesi için, bir ucuna (5'-ucu) kuvvetli bir promotor ve diğer ucuna da (3'-ucu) terminatör sekanslar ilave ederek bir mekik plasmid vektöre bağlanır.  

d) Sonra, bu rekombinant vektör hücrelere transfer edilir. Eğer, fazla gene gereksinim varsa, plasmid önce başka hücrelerde sayıca artırılır ve ondan sonra kullanılırlar.  

e) Hücre içinde, plasmidde bulunan DNA sekansları transkripte olur ve antisens RNA molekülü sentezlenir.  

f) Sentezlenen antisens RNA, hücrenin mRNA'sındaki hedef gene komplementer olduğundan onunla birleşerek dubleks (RNA - mRNA) kombinasyonu elde edilir. g) Bu çift iplikçik RNA kompleksi, ribosomlarda aktivite gösteremez ve gen inaktive olur (çift iplikçikli hedef gen bölgesi translasyona tabi tutulamaz).

Bu tekniğe ait aşamalar, çok kısa olarak aşağıdaki şekilde gösterilmiştir (burada ancak hücre içindeki olaylar belirtilmiştir).

Antimesenger oligodeoksiribonukleotidler (antimesenger oligomerler, oligonukleotidler) hücrelere girdikten sonra, mRNA üzerinde bulunan kendine komplementer sekanslarla birleşerek çift iplikçik (dubleks molekül) oluşturan ve böylece mRNA'nın translasyonuna mani olan tek iplikçik, kısa sentetik sekanslardır. İn vitro hücre kültürlerinde başarılı sonuçlar veren denemelerin, deneme hayvanları üzerinde de (in vivo) yapılması ve çok iyi değerlendirilmesi gereklidir.

Oligonukleotidler, özellikle, genomik RNA viruslarında mRNA'ya veya viral RNA'nın inhibisyonuna neden olduğundan, üzerinde çok çalışmalar yapılmaktadır. Kanatlıların Rous sarcoma virusunun (RSV) '35 S RNA'sının 5'-ve 3' terminuslarındaki tekrarlanan terminal sekanslara komplementer olan 13 bazlık oligonukleotidin, virusla infekte civciv embriyo fibroblast kültürlerinde 192-240 saat içinde revers transkriptaz aktivitesinde %90'lık bir azalmaya neden olduğu açıklanmıştır.

En fazla çalışma, insanlarda immunsupresyona yol açan virus (HIV) üzerinde yapılmış ve olumlu sonuçlar da alındığı açıklanmıştır. Ancak, in vivo koşullarda henüz olumlu bir çalışma bulunmaktadır. Hazırlanan oligomerlerin büyüklüğünün mRNA daki spesifik sekansların inhibisyonunda etkili olduğu bildirilmiştir.

Henüz çok az olan oligomer üretiminin artırılması durumunda daha rahat, güvenli ve çok sayıda çalışmalar yapılabilecektir.

Bu teknoloji aynı zamanda bazı terapötik ajanların (özellikle, gen tedavisinde, vs) hücre içinde istenilen yerlere dağıtılmasında ve hedef bölgeye iletilmesinde yararlar sağlayacağı da açıklanmıştır.

Antisens RNA teknolojisi, süs bitkilerinde pigmentasyonun manipulasyonunda, domates ve şeftali gibi meyvelerin yumuşamalarının geciktirilmesinde de kullanılabileceği belirtilmektedir.

Antisens RNA teknolojisi, insan ve hayvanların bazı viral hastalıklarında in vitro düzeyde yapılan çalışmalarda başarılı sonuçlar elde edildiği belirtilmiştir. Ancak, deneme hayvanlarında (in vivo) çalışmalar sürdürülmekte ve alınan sonuçlara, henüz olumlu gözle bakılmamaktadır. Çünkü oluşturulan dubleks tam kesinlik kazanmıştır. Çünkü, dubleks RNA molekülünün ribosomlarla interaksiyona girebileceği ve böylece protein sentezini tümden bozabileceği ve ayrıca, çekirdek içinde oluşan dubleks RNA-RNA molekülünün buradan sitoplazmaya aktarılmasında güçlüklerin olabileceği, pre-mRNA'dan intronların çıkarılması ve eksonların birleştirilmesi prosesisini önleyebileceği dubleks molekülün çekirdek içinde mi yoksa sitoplazmada mı gerçekleştiğinin tam saptanamaması, olgun mRNA'nın sitoplazmaya ne zaman geçtiğinin belirlenmemesi, oligomerlerin hücre çekirdeğine girebilme durumlarının ne olduğu ve diğer bazı olumsuzlukların olabileceği gibi sorunlar da henüz açıklığa kavuşturulmamıştır.

Prokaryotik ve ökaryotik organizmalarda, DNA'ya bağımlı RNA polimeraz enzimi (transkriptaz), DNA'daki    promoter bölgesine bağlanarak, iki  DNA iplikçiğinin   birinde   (sens   karakteri   gösteren ve  3' ¬¾¾ 5' yönünde olanından) bulunan genetik şifreleri aynen (yalnız, timin yerine urasil olmak üzere) yeni sentezlenen mRNA'ya transferini katalize eder (transkripsiyon). Bu mRNA da 5'¾¾®3' bir polariteye sahiptir ve kendinin sentezinde kalıp ödevi gören DNA'ya da anti paraleldir.

Eğer bu sentezlenen mRNA'da bulunan genlerden birinin inaktivasyonu isteniyorsa, o zaman, bu hedef genle komplementer olan ve birleşebilen sentetik bir antisens RNA sekansları hazırlanarak hücrelere transfer edilir. Bu oligomer sekanslar hücre içinde kendisine komplementer olan ve istenmeyen sekanslarla birleşerek (dubleks RNA) onun translasyonuna mani olurlar. Böylece istenmeyen genin aktivasyonu önlenmiş olur. (Antisens gen, normal genin mRNA'sına komplementer olan RNA moleküllerin sentezini kodlayan genlere denir). Antisens gen, hedef RNA'yı kodlayan DNA fragmentlerinin pozisyonuna ters oriyentasyonda, kuvvetli promotor ile terminatör sekanslar arasına koyarak hazırlanır ve bir plasmide bağlanarak hücreye transfer edilir.

Antisens RNA molekülü başlıca iki tarzda hazırlanabilmektedir. Bunlardan yaygın olarak kullanılan, yukarıda bahsedilen sentetik antisens oligomer RNA hazırlama ve kullanma teknolojisidir. Diğer bir yöntem de, mRNA üzerindeki istenmeyen hedef geni inaktive etmede, antisens RNA geni kullanmaktır. Böylece, hücre içinde, antisens RNA geni tarafından oluşturulan antisens RNA molekülünden yararlanılır. Burada bu son teknolojiden kısaca bahsedilecektir.

Bu yöntemde, hücre DNA'sında bulunan hedef genin polaritesine ters oryantasyonda bir gen hazırlamak, amaçlanır. Bu tarzda hazırlanan suni gen'e, prokaryotik ve/veya ökaryotik organizmalar içinde akivite gösterebilen kuvvetli bir promoter ile terminatör sekanslar ilave edilerek hücrelere transferi sağlanır. Hücre içinde, genin ekspresyonu, antisens RNA molekülünün de sentezine neden olur ve mRNA üzerindeki komplementer sekansla birleşerek onun translasyonuna mani olur.

Bu teknoloji ile üretilen antisens RNA molekülünün, ökaryotiklerde etkinliği hakkında bazı görüşler de ileri sürülmüştür. Bunlar kısaca şöyledir.

1) Antisens RNA molekülü, çekirdek içinde hedef DNA sekansları ile hibridize olabilir,  
2) Antisens RNA molekülü, çekirdek içinde normal mRNA'daki hedef sekanslarla birleşebilir,  
3) Oluşan dubleks RNA molekülü, çekirdek içinde veya sitoplazmaya geçtikten sonra RNase'lar tarafından kolayca ayrıştırılabilirler.  
4) Antisens RNA molekülü, pre mRNA'dan, intronların çıkarılması ve eksonların birleştirilmesi prosesine mani olur.  
5) Çekirdek içinde oluşan dubleks RNA molekülü çekirdekten sitoplazmaya geçemez.  
6) Oluşan dubleks RNA molekülü, sitoplazmada ribozomlarda interaksiyona girerek translasyonun başlama sinyalini bozar ve böylece protein sentezini (translasyon) önler.

Antisens RNA teknolojisi, insan ve hayvanlardaki bazı viral hastalıkların önlenmesinde başarı ile denenmiştir. İlerisi için ümit verici bir teknoloji olarak görülmektedir.

Bu teknoloji aynı zamanda, bazı terapötik ajanların (özellikle, gen tedavisinde, vs.) hücre içinde istenilen yerlere dağıtılmasında hedef bölgeye iletilmesinde yararlar sağlayacağı belirtilmektedir. Antisens RNA teknolojisinin, süs bitkilerinde pigmentasyonun manipulasyonunda, domates ve şeftali gibi meyvelerin yumuşamalarının geciktirilmesinde de kullanılabileceği ileri sürülmüştür.

04.05. Ribozimlerle İnaktivasyon 

Son yıllara kadar hücrelerde biyolojik olayların katabolize edilmesini sadece proteinlerin (enzimler) yaptığı düşünülürdü. Diğer bir ifade ile, enzimlerin protein karakterinde olacakları kabul edilirdi. Ancak, son zamanlarda, bazı RNA moleküllerinin de enzim gibi aktiviteye sahip olduğu ve reaksiyonları hızlandırabilecekleri ortaya konulmuştur. Böyle etkinliğe sahip RNA moleküllerine Ribozim (ribozyme, ribonukleik asit enzim) adı verilmekte, ve bir çok canlı organizmada bulunabilecekleri de belirtilmiştir. Ribozimlerin çoğu RNA moleküllerini ayrıştırmakta ve özellikle, pre mRNA'dan intronların çıkarılma prosesinde etkinliği olduğu bildirilmektedir.

mRNA üzerindeki hedef sekansların inaktivasyonunda etkinliği olan ribozim teknolojisinin esası kısaca yandaki şekilde  gösterilmiştir

mRNA üzerinde hidrolizan etkiye sahip olan ribozim genleri DNA'dan çıkarılarak buna kuvvetli bir promoter ile terminatör sekansları ilave edildikten sonra hücrelere etkin bir tarzda transfer etmek gereklidir. Genin hücre içinde ekspresyonu sonu sentezlenen ribozimler istenmeyen sekans üzerinde bir çok kesmeler yaparak genin bütünlüğünü bozar ve translasyonuna mani olur. Ribozim geni, sentetik olarak istenmeyen herhangi bir hedef sekansa yönelik hazırlanabilir ve kullanılabilir. Sentezlenen ribozim molekülleri hedef sekans üzerine bağlandıktan sonra ilmekler oluşturur ve mRNA'nın kesimi de bu ilmeklerin bulunduğu yerde meydana gelir. Bu bölgede, ribozim, mRNA'daki hedef sekanslara komplementerdir. Bu bölgenin dışında etkili olamazlar.

Ribozim geni verilerek transjenik hale getirilen hayvanlar kendi ribozimlerini üretebilirler.

Bu teknoloji aynı zamanda viruslara karşı dirençli organizmalar meydana getirmede yararlar sağlayabilir. Viral RNA'ya karşı hedeflenen ribozim genlerinin hücrelere transferi ve ekspresyonlarının, koruyucu etkisi bulunmaktadır.

Ribozim teknolojisi aynı zamanda peynir endüstrisinde starter kültürleri veya önemli mikroorganizmaları fajların litik etkisinden korumada da bir role sahip olacaktır. İleride, kendi ribozimini taşıyan transgenik bitkiler de elde edilebilecektir.

04.06. Rekombinant DNA Teknolojisi ile  İnaktivasyon 

Rekombinant DNA teknolojisi, biyoteknolojik yöntemlerin en önemlilerinden biridir. Hatta esasını oluşturur. Bu tekniği uygularken, özellikle, genlerin klonlanmasını yaparken, bir organizmadan çıkarılan hedef gen, alıcı veya konak bir prokaryotik veya ökaryotiğe transfer etmeden önce uygun vektörlerden birinde klonlanır. Ancak, bu klonlama sırasında, genellikle, seleksiyonda önemli fonksiyonu olan genlerin biri inaktive edilir. Bu genin içine hedef gen sekansları yerleştirilerek genin inaktivasyonu sağlanır. Bu inaktivite edilen gen, genellikle, antibiyotiklere dirençlilik sağlayan sekanslara sahiptir. Genin inaktivasyonu, antibiyotiğe organizmayı duyarlı hale getirir ve bu iyi bir seleksiyon ortamı sağlamış olur.

Bu konu üzerinde "Mikrobiyolojide Biyoteknoloji" bölümünde gerekli bilgiler verilmiştir.  

04.07. Feedback Mekanizma İle İnaktivasyon

Bir hücre içinde, veya organizmada gen ürününün fazla olduğu durumlarda, bu ürünlerin tersine bir mekanizma ile genin ekspresyonunu geçici bir süre için azaltması veya durdurması olayıdır. Buna en iyi örnek olarak, kanda fazla miktarda antikorun bulunduğu durumlarda uyarım için homolog antijen tekrar verildiğinde yeni bir stimulasyonun meydana gelmemesi ve antikor titresinde bir artmanın oluşmaması gösterilebilir. Hücre içinde aminoasitlerin fazla olduğu durumlarda da aynı fenomen gözlenebilir.

Feedback inhibisyon mekanizması yandaki şekilde gösterilmiştir.

05. Genlerin İzolasyonu

Rekombinant DNA teknolojisi yardımıyla genleri  izole etmek, üzerinde çalışmalar ve özellikle, genetik manipulasyonlar yapmak olanak dahiline girmiştir. Genlerin kromozom üzerindeki sayıları, organizmaların türlerine göre (prokaryotik-ökaryotik) genellikle, 1000 ile 100.000 arasında değişmektedir. Doğaldır ki bu kadar gen çokluğu arasında istenilen karakterleri taşıyan geni(ler) bulmak, izole ederek üzerinde gerekli çalışmaları yapmak oldukça zordur. Bu nedenle gen kütüphanesi (gene library) oluşturmak ve genleri burada toplayarak, gerektiğinde buradan faydalanmak daha kolaylık ve güven sağladığı gibi zamandan da tasarruf ettirir.

Bu amaca ulaşmak için genomik DNA'lardan yararlanılır. Saf olarak elde edilen genomik DNA, genlerin büyüklüğünü dikkate alarak uygun bir veya iki restriksiyon enzimi ile kesilir.  Plasmid de  virusa (vaccinia) ve faja (lambda) transfer edilerek buradan alıcı bir hücreye (prokaryotik veya ökaryotik) transfekte edilir. Prokaryotiklerden, genellikle, E. coli ve B. subtilis, ökaryotiklerden de maya (protoplastı) fazlaca kullanılmaktadır. Alıcı hücrelerde klonlanan genlerle oluşturulan kütüphaneler gerektiğinde özel işaretli problar yardımıyla istenilen genler yönünden taranırlar.

Genlerin yerlerini belirlemede veya istenilen geni veya gen ürününü ortaya koymada değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar arasında başlıcaları kısaca şöyledir.

1) Problarla genlerin yerinin belirlenmesi,  
2) Gen ürünü olan proteinlerin belirlenmesi ile genin varlığı hakkında bilgi edinilebilir. İmmunolojik bir yöntemdir. 3) Transpozonlardan (Tn) yararlanarak DNA üzerinde genin bulunduğu yer saptanabilir. Şöyle ki, eğer bir mikroorganizma Lac+ ise ve bu mikroorganizmaya bir transpozon katılırsa, bu da gen içine girerse, genin bütünlüğü bozularak inaktive olur ve Lac- hale döner. Bu durumdan yararlanılarak, Transpozonun gen yapısı bilindiğinden, buna komplementer olarak hazırlanan problarla hibridize edilir ve otoradyografi ile transpozonun ve dolayısıyla da genin yeri belirlenir.  
4) Hedef DNA sekanslarını ortaya koymada, diğer organizmalarda bulunan aynı genin kritik fonksiyonel bölgesi analog olan problar da kullanılabilir. Bu problar PCR ile amplifiye edilerek çoğaltılır, pürifiye edilir ve gen kütüphanesinde spesifik gen taramak için kullanılabilir.  

06. Mikrosatelitler  (Minisatelitler)

Genellikle ökaryotik kormozomlarda bulunan, rast gele tekrarlanan (ve genetik informasyon taşımayan) küçük DNA sekanslarıdırlar (<100 bp). Kolaylıkla amplifiye edilebilir ve klonlanabilirler. Bu mikrosatelitler insan hekimliğinde babalık testlerinde, kalıtsal hastalıkların teşhisinde ve genetik haritaların yapılmasında kullanılabilirler. Mikrosatelitler çiftlik hayvanlarında, verim, büyüme hızı, vs. parametrelerin saptanmasında da yardımcı olabilmektedir.

İnsan genomunda 4-20 bp uzunlukta 400'den fazla mikrosatelit saptanabilmiştir. İnsanlarda X-kromozomunda her 300-500 kbp'de bir tane 3-4 nukleotidden oluşmuş mikrosatelite bulunmaktadır. Bunların hepsi identik değildirler.

İnsan ile fare satelitleri arasında benzerlik bulunduğundan, fareler, insan hastalıklarında model olarak kullanılabilirler.

Mikrosatelitler insanlarda A, AC, AAN, AAAN ve AG gibi kodlarla belirlenen gruplara ayrılırlar.  

07. DNA'da Tekrarlar ve  Sekonder Yapılar

Bazı DNA moleküllerinde iki kopya halinde identik, birbirine düz (doğru) veya ters oriyentasyonda kısa sekanslar bulunmaktadır. Bunlardan birincilerine direkt tekrarlar (direct repeat) ve ikincilere de ters tekrarlar (inverted repeat) adı verilmektedir. Bir DNA segmentinde veya molekülünde orta eksene göre tersine tekrarlar palindromik sekanslar olarak da adlandırılmaktadır. Buna, aşağıda örnek verilmiştir. Tersine tekrarlar orta eksene göre çapraz durumdadırlar.

Tersine tekrarların her zaman birbirlerine komşu olması gerekmez, uzakta da olabilirler.

Çift iplikçikli lineer DNA'ya sahip olan Lambda fajının iki ucunda da tek iplikçik ve birbirine tersine baz sıralarına sahip olan ve 12 bazdan oluşan yapışkan uçlar bulunmaktadır. Ancak, buradaki bazlar birbirinin komplementeri olup gerektiğinde birleşebilirler.

5' .GGGCGGCG ACCT....../     /.....

                              ..../    /....AGGTCG CCG CCC .5'

Restriksiyon endonukleazlardan olan EcoR1 çift iplikçikli DNA'larda oluşturduğu karşılıklı kesimlerin sonunda meydana gelen uçlar da birbirlerinin komplementeri olup yapışkan uç olarak adlandırılırlar (kohezif uçlar) Ancak, bu tarz kesimlerde, her bir DNA iplikçiğinde sadece bir tane tersine tekrar vardır.

Oluşan yapışkan uçlar

Restriksiyon endonukleazlardan olan PvII'nin çift iplikçikli DNA da kesim bölgesinde küt uçlar oluşur ve burada bazlar, orta eksene göre tersine tekrarlar (palindromik sekanslar) halindedirler.
Tersine tekrarlar DNA'da artı (+) benzeri veya birbirine ters saç tokası gibi sekonder yapılar meydana getirebilirler. Bu durum tek iplikçik RNA'da ise sadece saç tokası gibi bir konformasyona neden olur.
Kompozit Transpozonların da her iki uçunda hem tersine tekrarlar ve hem de direkt tekrarlar bulunmaktadır. Örn, Tn 3'ün moleküler yapısı.

[1] Kaynak: Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 45525 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader