Vitamin B 12 (Lactobacillus) Assay Broth, Base

Vitamin B12 (Lactobacillus) Assay Broth, Base (Merck 1.11988)

AOAC ve USP yönergelerine uygundur. Đlaç, gıda, yem ve diğer pek çok sektörde In vitro (canlı hücre dışında) olarak, mikroorganizmalar kullanılarak vitamin miktarı tayininde kullanılan sıvı besiyeridir.

Bazı bakteri türleri ve mayalar belirli vitaminlere karşı tam bağımlılık özelliği gösterirler. Bu mikroorganizmalar, (ihtiyaç duydukları vitamin hariç) gelişmeleri için gerekli olan bileşenlerin tamamını içeren bir besiyerine ilave edildiklerinde gelişmelerini tamamen durdururlar ya da hızla azaltırlar. Đhtiyaç duydukları vitaminin ilave edilmesi ile mikroorganizmalar gelişmeye başlar ve bu gelişim, ilave edilen vitaminin konsantrasyonuna bağlı olarak değişir. Bu yönteme dayanarak bazı vitaminlerin konsantrasyonları, mikroorganizmalar kullanılarak, mikrobiyel gelişme sonucu oluşan bulanıklığın (türbidimetrik olarak) veya metabolitlerin (ör. laktik asit) (titrimetrik olarak) ölçülmesi ile kantitatif olarak belirlenebilir. Özelliği ve miktardaki bilinen saf vitaminin artan konsantrasyonları ile gerçekleştirilmiş paralel çalışmalar, bu vitamin için analiz standardını oluşturur.

Bileşimi

D(+) Glucose anhydrous 40 g/L; Casein hydrolysate "Vitaminfree" 15 g/L; DLAlanine; LAsparagine 200 mg/L; LCysteinium chloride 200 mg/L; LCysteine 400 mg/L; LTryptophane 200 mg/L; Adenine 20 mg/L; Guanosin 40 mg/L; Uracil 20 mg/L; Xanthine 20 mg/L; 4Aminobenzoic acid 2 mg/L; L(+) Ascorbic acid 4 g/L; D(+) Biotin (Vitamin H) 10 g/L; Calcium D(+) pantothenate 1 mg/L; Folic acid 200 g/L; Nicotin acid 2 mg/L; Pyridoxol hydrochloride 4 mg/L; Pyridoxamine hydrochloride 800 g/L; Riboflavin 1 mg/L; Thiaminium dichloride 1 g/L; dipotassium hydrogen phosphate 1 g/L; Iron(II) sulfate 20 mg/L; Potassium dihydrogen phosphate 1 g/L; Manganese(II) sulfate 20 mg/L; triSodium citrate dihydrate; Sodium acetate anhydrous 20 g/L; Sodium chloride 20 mg/L şeklindedir.

Hazırlanması

Dehidre besiyerinden 83 g kısa süreli kaynatma ile 2 ml Tween®80 ve 1 L bidistile su içinde eritilir. MikroInoculum Broth bileşimi, Proteose peptone 5,0 g/L; Yeast extract 20,0 g/L; D(+)glucose 10,0 g/L; Potassium dihydrogen phosphate 2,0 g/L; Tween 80 0,1 ml/L şeklindedir. 10 g Agar, MicroInoculum Broth'a ilave edilir ve otoklavda 121 oC'da 15 dakika sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası 25 oC'da pH'sı 6,7±0,1'dir.

Analiz Yöntemi

Dehidre besiyerinden 83 g 2 ml Tween 80 ve 1 L bidistile su içinde eritilir. Sık sık çalkalayarak 23 dakika gibi kısa süreli kaynatma uygulanır. Analiz edilecek örnek, dilüsyon serisi şeklinde tüplere konur ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır. Hazırlanmış bu tüplere 5'er mL besiyeri dağıtılır ve sterilize edilir. Soğutulmuş tüplere 1'er damla inokülasyon kültürü ilave edilir. 37 oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır. Oluşan bulanıklık 546 nm dalga boyunda fotometrik olarak ölçülür.

Vitamin B12 Testi

Örnek hazırlama: Analiz edilecek örnekte B12 vitamini serbest formda ise (ör. toz veya tablet şeklindeki ilaçlar) basit olarak su ile ekstarakte edilir. B12 vitamini bağ oluşturmuş durumdaysa tampon çözeltiler veya enzimatik hidroliz ile serbest hale getirilir.

Tampon Çözelti: 1 g örnek 50 mL tampon çözelti (içerik: 1.29 g disodium hydrogen phosphate, 1.1 g citric acid ve 1.0 g sodium disulfite 100 mL distile suda eritilir) içerisinde homojenize edilir ve 121 oC'da 10 dakika otoklavlanır. Soğutulduktan sonra pH 6,0'a ayarlanır, steril distile su ile 100 mL'ye tamamlanır ve filtre (veya santrifüj) edilir.

Enzimatik hidroliz: 1 g örnek 80 mL acetate buffer çözeltisinde homojenize edilir. Bu çözeltiye papain, amilaz (diyastaz) ve birkaç damla tolüen veya kloroform ilave edilir. 37 oC'da 24 saat bekletildikten sonra 100 oC'da 30 dakika ısıtılır. Soğutulduktan sonra Na2SO4 ile pH 6,6'ya ayarlanır, standart acetate buffer ile 100 mL'ye tamamlanır ve filtre (veya santrifüj) edilir. B12 vitamin miktarı bilinmeyen örnek analiz edilecekse ise öncelikle genel bir miktar belirlemesi yapılmalıdır. Bunun için, mümkünse, konsantre edilmiş ekstrakt hazırlanır ve 10'lu dilüsyon (seyreltme) serileri şeklinde analiz edilir.

Đnokülasyon: Lactobacillus delbrueckii var. lactis (ATCC 7830) suşu MicroInoculum Broth'a ekilerek 37 oC'da 20 saat inkübasyona bırakılır. Daha sonra kültür santrifüj edilir, fizyolojik tuzlu su ile 3 defa yıkanır ve mikrobiyel sayı 108 bakteri/mL olacak şekilde ayarlanır.

Kalibrasyon: Cyanocobalamin (vitamin B12) 100 mg/L olacak şekilde bidistile suda (içerik: 100 mcg/mL) eritilir ve 1 ng/mL'ye seyreltilerek referans çözelti hazırlanır. Bu çözeltiden 0255075100125150200500 ng cyanocobalamin/10 mL dilüsyon (seyreltme) serisi oluşturacak şekilde tüplere 0.00.250.500.751.01.251.52.05.0 mL çözelti pipetlenir ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır. Kontrol tüplerine (kültür ve sterilite kontrolü için) sadece 5,0 mL damıtık su konulur.

Örnek: Analiz edilecek örnek çözelti, kalibrasyon aşamasındaki gibi dilüsyon (seyreltme) seriler şeklinde

tüplere dağıtılır ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır. Besiyeri hazırlama, inokülasyon: Dehidre Vitamin B12 (Lactobacillus) Assay Broth, Base besiyerinden 75 g kısa süreli kaynatma ile 2 mL Tween 80 ve 1 L bidistile su içinde eritilir. pH kontrol edilir ve gerekirse ayarlanır (25 oC'da pH'sı 6,0). Örnek ve referans çözelti dilüsyonlarını içeren tüm tüplere 5 mL kültür besiyeri kontrollü bir şekilde ilave edilir ve tüpler kapakları kapatılarak otoklavda 115 oC'da 10 dakika sterilize edilir. Soğutulmuş tüplere 1'er damla aşılama kültürü ilave edilir (sterilite kontrol tüpleri hariç). 37 oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır.

Değerlendirme: Tüm tüpler fotometrik olarak 546 nm dalga boyunda incelenir ve optik bulanıklıkları (OD) ölçülür. Referans çözelti ile hazırlanmış tüplerden ölçülen bulanıklık değerleri standart madde miktarına karşılık gelecek şekilde bir grafiğe aktarılır ve kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Analiz edilen örnekteki cyanocobalamin (vitamin B12) miktarı bu eğriye göre hesaplanır. Suya karşı kontrol kültürle yapılan okumalarda OD (546 nm, 1 c) < 0,150 olması durumunda analiz sonuçları anlamlı olmaktadır. Sterilite kontrol tüplerinde herhangi bir üreme (bulanıklık) olmamalıdır.

Kalite Kontrol

Test mikroorganizmaları Ekim Gelişme
Lactobacillus delbrueckii var. lactis (ATCC 7830) % 50 T'de ayarlı (630 nm, 1 cm küvet, % 0,9 NaCl'ye karşı) Kalibrasyon eğrisi 25300 ng Vit B12 değerleri arasında gelişmeyi gösterir

Ürün Bilgileri

Ürün Adı Merck Kat. No. Ambalaj Ürün Adı Merck Kat. No. Ambalaj
Vitamin B12 (Lactobacillus) 1.11988.0100 100 g Nicotinic acid 1.06817.0100 100 g
Assay Broth, Base Pancreatin DAB 1.07133.0500 500 g
αAmylase 1.01329.0001 1 g Papain, watersoluble 1.07144.0025 25 g
0,2 N NaOH solution 1.09140.1000 1 L Sodium acetate, anhydrous 1.06268.0250 250 g
Acetate buffer sol. pH 4,66 1.07827.1000 1 L NaCl 1.06404.0500 500 g
Agaragar purified 1.01614.1000 1 kg Sodium disulfite 1.06528.0100 100 g
Calcium D(+)pantothenate 1.02316.0010 10 g NaOH solution 0,1 N 1.09141.1000 1L
Chloroform 1.02445.0250 250 mL NaOH solution 1 mol/L 1.09137.1000 1 L
Citric acid monohydrate 1.00244.0500 500 g Sulfuric acid 1,0 N 1.09072.1000 1 L
D(+)Biotin (Vitamin H) 1.24514.0001 1 g Toluene 1.08325.1000 1 L
Na2HPO4 1.06586.0500 500 g Tween 80 8.22187.0500 500 mL
Folic acid for biochemistry 1.03984.0005 5 g Vit. B12 (cyanocobalamin) 1.24592.0100 100 mg
Hydrochloric acid 0,5 N 1.09058.1000 1 L Nicotinamide 1.06818.0100 100 g

Bu sayfa 4460 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader