Viral İnfeksiyonlarda Laboratuvar Tanısı

Viral  İnfeksiyonlarda  Laboratuvar  Tanısı  

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji
1

01. Genel Bilgiler  
02. Muayene Materyallerinin  Alınması, Gönderilmesi  ve İşlenmesi

02.01. Materyallerin (Örneklerin) Alınması ve Gönderilmesi 
02.02. Örneklerin İşlenmesi  
03. Laboratuvar Muayeneleri
 
03.01. Klasik (konvansiyonel) Yöntemler 
03.02. Biyoteknolojik (Moleküler) Yöntemler  
04.Viral  Antijenlerin  ve  Viral  Antikorların Saptanmasında Kullanılan  Başlıca  Serolojik Yöntemler
 
04.01. Nötralizasyon Testi 
04.02. Lateks Aglütinasyonu 
04.03. Hemadsorbsiyon-İnhibisyon Testi 
04.04. Hemaglutinasyon (HA) ve Hemaglutinasyon İnhibisyon (HI) Testi 
04.05. Paul-Bunnel Testi 
04.06. İmmunfluoresans Antikor (IFA) Testi 
04.07. Radioimmunassay (RIA) 
04.08. Enzyme Linked İmmunosorbent Assay (ELISA) 
04.09. Komplement Fikzasyon (KF) Testi 
04.10. Agar Gel İmmunodifusyon (AGİD) 
04.11. İnfektivite İnterferens Testi 
04.12. İmmunperoksidaz Testi

01. Genel Bilgiler

Diğer etkenlerden (bakteri, mantar, parazit) ileri gelen hastalıklarda olduğu gibi, viral infeksiyonların tanısında da laboratuvar muayenelerinin özel ve çok önemli bir yeri vardır. Her ne kadar kliniklerde yapılan ön tetkikler (anamnez, çeşitli klinik incelemeler, hematolojik, biyokimyasal, radyolojik, vs) hastalıkların belirlenmesinde ilk adımı oluşturması, laboratuvarda çalışanlara yardımcı olması, işlemleri kolaylaştırması ve yönlendirmesi bakımlarından çok değerli iseler de, yine de tanı için yeterli değildirler ve kesin çözümü sağlayacak olan laboratuvar muayenelerine gereksinim vardır. Şöyle ki, bazen bir virus türü ile infekte bireylerde değişik klinik belirtiler saptanabildiği gibi, farklı cinse veya familyaya ait viruslar da, benzer klinik ve otopsi tablosu gösterebilirler. Ayrıca, persistent, latent, subklinik ve perakut infeksiyonlarda da teşhise yardımcı olacak spesifik semptomlar ortaya çıkmazlar. Oluşan bazı genel belirler de teşhis için yeterli değildirler.

Laboratuvar muayenelerinde de bazen benzer şüpheli durumlar ortaya çıkmakta ve kesin teşhis uzatmakta ve ara sıra da hiç bir sonuç elde edilememektedir. Şöyle ki bazen virus izolasyon ve identifikasyon çalışmalarında ve çeşitli serolojik testlerde kesin tanı için bir-iki hafta gerekli olmaktadır. Bazı durumlarda mikroskopik muayenelerde, virus partiküllerine, inklusiyon cisimciklerine ve diğer sitolojik bozukluklara rastlanmasına karşın, böyle olgulardan her zaman virus izole edilememektedir. Bir kısım vakalarda da izole edilen etkenin primer ajan olduğundan şüphe edilebilir. Serolojik testlerde de kros reaksiyonlar, yalancı pozitiflik, negatiflik ve şüpheli durumlar çoğu zaman ortaya çıkmaktadır. Böyle olgular emek ve zaman kaybına neden olduğu gibi infeksiyonun ilerlemesine, yayılmasına, ayrıca prognozun ağırlaşmasına, hastanın hayatının tehlikeye girmesine, koruyucu ve sağaltıcı önlemlerin zamanında alınamamasına da yol açmaktadırlar.

Son yıllarda geliştirilen ileri ve moleküler metotlar, yukarıda açıklanan konvansiyonel tekniklerin dezavantajlarına açıklık kazandırmakta, kesin tanı için daha güvenli, çabuk ve spesifik sonuçlar vermektedir. Diğer bir önemli noktada, laboratuvar çalışmaları, klinik muayenelerinin daha üstünde, ötesinde ve ilerisinde olup kesin tanıyı belirleyecek nitelik taşırlar. Ancak, bu son yöntemlerin avantajları yanı sıra , bazı dezavantajları da vardır ve cevap veremediği bazı olgular da bulunmaktadır.

Viral infeksiyonların kesin tanısını laboratuvarlar verecekleri için, buralardaki elemanların çok iyi yetişmiş, bilgili ve becerikli olmaları, çok duyarlı ve gelişmiş aletlerin ve kitlerin kullanmaları ve laboratuvarların günün koşullarına tam cevap verecek nitelikte ve nicelikte olmaları gereklidir.

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında, viral infeksiyonların tanısında rutin çalışmalarda kullanılan başlıca uygulanmalar ve metotlar aşağıda özetle açıklanmaktadır.  

02. Muayene Materyallerinin  Alınması, Gönderilmesi  ve İşlenmesi

02.01. Materyallerin (Örneklerin) Alınması ve Gönderilmesi

Virolojik muayeneler için infekte bireylerden alınacak örnekleri, hastalığın yerleştiği bölgelere ve infeksiyonun karakterine göre değişmek üzere, genellikle, sıvılar (kan, serum, beyin omurilik sıvısı (BOS), idrar, süt, pleura-periton sıvıları, vajinal ve uterus akıntıları, diğer sıvılar), katı materyaller (gaita, biopsi ve otopsi maddeleri) ile eküvyonlar (çeşitli sıvılara emdirilmiş svablar) oluşturmaktadırlar.

Önemli olan nokta, bu muayene materyallerinin infeksiyonun erken dönemlerinde (başlangıcında), zamanında, yeterli miktarda, lezyonlu bölgelerden, mümkün olduğu kadar aseptik koşullarda ve steril kaplar (tüp, pepsi kutusu, kavanoz, özel kaplar, vs) içine alınarak en kısa zamanda laboratuvara gönderilmesi ve burada da hiç vakit geçirilmeden işlenmeye alınmasıdır. Eğer aradan kısa bir süre geçecekse ve laboratuvar henüz hazır değilse, materyaller buzdolabı ısında (+4°C de) muhafaza edilebilir. Eğer 2-4 gün gibi daha uzun bir süre geçecekse, bu zaman deepfrezer'a konabilirler. Şunu da unutmamak gerekir ki, örneklerin donması ve çözülmesi, antikorlarda titre kaybına ve viruslarda da inaktivasyonlara neden olabileceğidir.

Laboratuvara gönderilen materyaller, oda ısısında tutulmamalı, kontaminasyonlarına, bozulmalarına, dökülmelerine ve etrafa bulaşmalarına asla meydan verilmemelidir. Mikrobiyolojik yoklamalar için kullanılacak örnekler, bir fiksatif veya inaktivan madde içine alınmamalıdır. Eküvyonlar, gerektiğinde, taşıyıcı özel sıvılar içine konarak gönderilebilirler.

Kliniklerdeki görevliler laboratuvar çalışanlarını yönlendirmek ve bilgilendirmek için, alınan örnekler hakkında kısa özlü açıklayıcı bilgileri içeren bir yazıyı da birlikte göndermeleri gereklidir.

Örneklerin, infeksiyonun başlangıcında alınması izolasyon şansını artırır. Çünkü, virus çoğalmasının en fazla olduğu, buna karşın kanda antikorun yok veya çok az olduğu bir zamandır. Hastalığın ileri dönemlerinden, (kanda antikorların yüksek olduğu anlar) konvalesans periodda, kronik olgulardan, yanlış bölgelerden, steril olmayan aletle alınması ve kontamine kaplara konulması durumlarında izolasyon yapmak hem zordur ve hem de olanaksızdır. Bozulmuş, bekletilmiş ve kontaminasyondan şüpheli materyaller asla kullanılmamalıdır.

02.02. Örneklerin İşlenmesi

Laboratuvara getirilen katı örnekler, steril kabinet içine alındıktan sonra, muhafaza kaplarından çıkarılarak önce makroskopik muayeneden geçirilir ve genel durumu hakkında (lezyonların yeri, bozulma durumları, vs) bir bilgi elde edilir. Katı materyallerin uygun yerlerinden alınan, antibiyotikli buffer (veya Hanks, Earle) sol. içinde 1/5 veya 1/10 oranı olacak tarzda bir suspansiyonu hazırlanır. Bu amaç için en iyi madeni steril küçük mikserler kullanılabilir (eğer bunlar yoksa, steril bir havan veya homojenizatörlerden yararlanılır). Soğukta yapılan bu homojenizasyon işleminden yaklaşık 30-45 dk. sonra suspansiyon, soğukta, 30 dakika süre ile 5000 rpm/dk santrifüje edilir ve üst sıvıdan aerobik ve anaerobik koşullarda sıvı ve katı besi yerlerine ekimler yapılarak kültürler 37°C de 24 saat inkubasyona bırakılır. Bu sürenin sonunda steril çıkanlardan canlı sistemlere (embriyolu yumurta, hücre kültürü ve deneme hayvanlarına) ekimler yapılır. Suspansiyon ekim sonuçları alınıncaya kadar (24 saat için) buzdolabı ısısında (+4°C) muhafaza edilirler.

Sıvı materyallerden de önce boyanarak kontaminasyon kontrolü yapılır ve sonra aynı oranda bir suspansiyon hazırlanır santrifüje edilir ve kontaminasyon kontrolü yapıldıktan sonra ekilirler.

Eküvyonlar da, durumlarına göre 2-5 ml. antibiyotikli Hanks sol. içinde bir süre (4-5 saat) buzdolabında bırakıldıktan sonra sterilite kontrolleri yapılır. Steril çıkanlar ekilir.

Gerek duyulursa, katı, sıvı ve eküvyon sıvılarından inokulumlar hazırlanmadan önce, boyalı preparatlar yapılarak kontaminasyonlar yönünden incelenir, materyaller hakkında genel bir fikir elde edilir ve ona göre antibiyotik ayarlaması yapılır.

Bütün bu işlemler sırasında, maske, başlık ve eldiven takılmalı, laboratuvar tozsuz ve girip-çıkanı az olmalıdır.

03. Laboratuvar Muayeneleri

Materyaller ekim için hazırlandıktan ve sterilite kontrolleri yapıldıktan sonra rutin çalışmalarda aşağıdaki yöntemler, genellikle, uygulanmaktadır. Ancak, laboratuvardaki çalışanlar, kendi bilgi, becerileri ve olanaklarına göre uygun metotlar kullanılabilirler.

A) Klasik (konvansiyonel) Yöntemler

1) Mikroskopik muayeneler (virusların görüntülenmesi)  
2) Virusların izolasyonları (direkt etiyolojik teşhis)  
3) Virusların ve viral substansların saptanması  
4) Spesifik antikorların saptanması (serolojik testler, indirekt etiyolojik teşhis)

B) Biyoteknolojik (moleküler) Yöntemler

1) Prob hibridizasyon yöntemleri  
2) Target (hedef) sekans amplifikasyonu  

03.01. Klasik (konvansiyonel) Yöntemler

1) Mikroskopik muayeneler (virusların görüntülenmesi): Virusların preparatlarda görüntülenmesinde değişik mikroskoplardan yararlanılmaktadır. Bu amaçla en fazla kullanılan mikroskop muayeneleri aşağıda belirtilmiştir.

a) Mikroskopi: Işık mikroskopları (1000 x, 1500 x büyütmeli) ile virusları görüntülemek mümkün değilse de (Poxviridae familyası virusları hariç), infeksiyonların değişik aşamalarda hücrelerde oluşan, inklusiyon cisimciklerini (genellikle, virus partiküllerinin üredikleri ve kümeleştiği bölgeler), gerek sürme preparatlarda ve gerekse dokulardan (hücre kültürleri, embriyolu yumurtalar, biopsi ve organ-doku parçalarında) yapılan boyalı kesitlerde saptamak olasıdır. Bu cisimcikler, sitoplasma içinde (intrasitoplasmik: çiçek, kuduz, influenza, vs), nukleus içinde (intranukleer: adenoviruslar, herpes virusları, poxvirusları, vs.) veya her iki bölgede de (kızamık virusu, vs) lokalizasyon gösterebilirler: Aynı zamanda, eosinofilik (herpesvirusları, papovavirusları, vs) veya bazofilik (adenovirusları) bir özellik te gösterebilirler.

Virusların bu karakterleri, kendileri hakkında az da olsa bir fikir verebilir.

Histopatolojik boyalı kesitlerde, inklusiyonlar yanı sıra dev hücreleri, sinsityal hücreler, piknozis, fokus formasyonları ve diğer morfolojik değişikler de gözlenebilirler.

Ancak, inklusiyonların veya diğer sitopatolojik bozuklukların görülmemesi, hiç bir zaman viral infeksiyon ihtimalini ortadan kaldırmaz. Görülmesi de kesin bir tanı olarak kabul edilmemeli, şüpheli olarak dikkate alınmalıdır.

b) Fluoresans mikroskopi: Bir antijen antikor reaksiyonu üzerine kurulu olan bu teknikte, büyük veya orta büyüklükte viruslar (antijenik substanslar) ile inklusiyonları, oluşan sarı-yeşil fluoresans parıltı ile saptamak mümkündür. Ancak, virusların boyutları ve şekilleri hakkında pek kesin bilgiler elde edilemez. Doku ve sıvılardan, temiz ince bir lâm üzerinde sürme preparat hazırlanarak asetonla kurutulur. Üzerine, fluoresans bir boya (FITC, Auramin, Rhodamin vs) ile boyanmış, homolog antikorlar ilave edilerek preparattaki antijenle birleşmesi sağlanır. Bir süre sonra preparat UV-ışınları ile çalışan mikroskopta, virusa (viral antijenlere) bağlanmış boyalı antikorlar, sarı-parlak bir fluoresans vererek kolayca saptanabilirler (pozitif reaksiyon). Hiç bir parıltı yoksa negatif olarak değerlendirilir.

IFA tekniği, parainfluenza, influenza, kuduz, coronaviruslar, adenoviruslar, herpesvirusları, ve diğer virusları görüntülemede kullanılmıştır.

c) İmmünperoksidaz tekniği: Bu yöntem de viral antijenik maddeleri saptamada yardımcı olur. Ancak, bunda ışık mikroskoplarından yararlanılır.

Bu iki teknik hakkında bahsin sonunda gerekli bilgiler verilmektedir.

d) Elektron mikroskopi: Elektron mikroskopların çok pahalı, komplike olması, hem mikroskopların ve hem de preparatların muayene için hazırlanmaları, değerlendirilmeleri, yorucu, zaman alıcı ve aynı zamanda bilgi isteyen önemli bir uğraşıdır. Bu nedenle de, bu mikroskoplar üniversitelerde veya çok önemli araştırma merkezlerinde bulunur ve herkesin yararına sunulur.

Mikroskopta virusu gözleyebilmek için, kullanılan suspansiyonun 1 ml. sinde 106-109 virus partikülünün bulunması gerekir. Aynı zamanda görülen ve virusa benzeyen partiküllerinin de gerçek virus olup olmadığına da karar vermek oldukça zordur.

Elektron mikroskopta, şüpheli materyallerden hazırlanan suspansiyonlar yanı sıra dokulardan yapılan kesitler de muayene edilebilirler.

Virus suspansiyonları içine katılan homolog antikorlar, virus partiküllerini kümeleştirerek elektron mikroskop altında daha kolay bir görüntü elde edilebilir (immun elekronmikroskopi) ve diğerlerinden daha güvenilir sonuçlar verebilir.

Elektron mikroskoplar, objeleri bir milyon defa büyütebilir ve morfolojileri hakkında ayrıntı bilgiler elde edilebilir.

Bu mikroskoplarla da, virus partikülleri, inklusiyon cisimcikleri, dev hücreleri ve diğer morfolojik değişiklikler gözlenebilirler.

2) Virusların izolasyonu (direkt etiyolojik teşhis): Viruslar hücre paraziti olduklarından canlı hücrelerde üreyebilirler. Bu nedenle virusları laboratuvarlarda izole edebilmek, üretmek, bazı araştırmalar yapabilmek ve aşılar hazırlayabilmek için canlı sistemlerden (hücre kültürleri, embriyolu yumurtalar ve deneme hayvanları) yararlanılır.

Ancak, bu sistemlerin her laboratuvarda bulunması mümkün değildir. Bunların hazırlanabilmesi için özel ünitelere, bilgili ve deneyimli elemanlara gereksinim vardır. Hücre kültürleri, hücre bankalarından, SPF karakterindeki embriyolu yumurtalar özel çiftliklerden (eğer bu amaç için üretim varsa) ve deneme hayvanları da aynı tarzda üretilen merkezlerden temin edilebilir ve kullanılabilirler. Şunu da unutmamak gerekir ki bunlar alındıkları zaman, konabilecekleri yerleri, ve bunlara ait diğer imkânları önceden hazırlamak gerekir. Aksi hallerde, kontaminasyonlar nedenleriyle kullanılamaz duruma gelirler veya yanlış sonuçların elde edilmesine yol açarlar.

a) Hücre kültürleri: Virusların izolasyonlarında, çeşitli karakterlere sahip olan hücrelerden yararlanılır. Önemli olan nokta, kullanılacak hücrelerin virusa duyarlı olmasıdır. Aksi durumlarda izolasyon gerçekleştirilemez.

Laboratuvarlarda, virusun türüne ve üreme karakterlerine göre, primer, sekonder, cell-line, devamlı hücreler, suspanse hücreler, vs kullanılabilirler. Bunların canlı orijinleri (insan, memeli hayvan, tavuk, balık, vs), hücre tipleri (epitel, fibroblast, lenfosit, vs) ve organ türleri (böbrek, karaciğer, epitel, testis, kas, kemik iliği, vs) oldukça farklıdır.

Virusların üredikleri, hücrelerde oluşan morfolojik değişikliklerle (CPE, sitopatik efektler), fokus formasyonu, dev hücreler, piknozis, yuvarlaklaşma, yapıştıkları katı yüzeyden (cam, plastik, vs) düşme, pH da çok az bir değişme (eğer kontaminasyonlar yoksa) ve diğer bazı sitolojik değişmelerle anlaşılabilir (sitosidal infeksiyon), Ancak, bazı viruslar da, hücrelerde üremelerine karşın herhangi bir dejenerasyonlar oluşturmayabilir (persistent infeksiyon). Her iki tür infeksiyonda da virus üremesine rastlanır. Ancak, latent infeksiyonlarda (retrovirusları, vs) viral genom, hücre kromozomuna integre olur ve böylece hücrelere transfer edilir. Bu tür infeksiyonda viruslarda üreme yoktur ve hücrelerde değişiklikler de gözlenemez (nonsitosidal infeksiyon).

Virusların ürediği çeşitli tekniklerle ortaya konulur. Gerektiğinde pasajlara devam edilerek, üreme  durumu açıklığa kavuşturulur.

b) Embriyolu yumurtalar: Bu canlı sistemlerde virusların izolasyonlarında, bazı virolojik testleri yapmada ve aşı üretiminde kullanılabilirler. Yumurtaların da SPF karakterde olması arzu edilen önemli bir noktadır.

Embriyolu yumurtaların çeşitli yerlerine (korioallantoik boşluk, amnion boşluğu korioallantoik membran üzerine, embriyoya, vs), hazırlanan steril inokulumlardan 0,1-0,4 ml miktarında verilir.

Ölen  embriyolardan usule  göre  allantoik-amnionik sıvılar veya doku parçaları alınarak, virus yönünden incelenirler. Gerekirse, tekrar pasajlar yapılır.

c) Deneme hayvanları: Deneme hayvanlarının bakım ve beslenmeleri yanısıra yetiştirilmeleri ve en önemlisi de sağlık sorunları oldukça problem yaratabilir. Kullanılacak deneme hayvanlarının da, SPF karakterde yetiştirilen yerlerden temin edilmiş olması, denemelerin sağlıklı yürümesi bakımından önemlidir.

Bu hayvanların da çeşitli yerlerine (iv,sc,im,ıc,vs) inokulasyonlar yapılır. Hayvanlar her gün klinik gözlem altında tutulur ve durumları kaydedilir. Ölenler varsa otopsi yapılacak makroskopik bozukluklar değerlendirilir. Ölmeden önce hayvanlardan kan alınarak antikor bakımından da incelenebilir. Ölen hayvanlardan alınan dokulardan histopatolojik kesitler yapılarak dokularda meydana gelen bozukluklar virus yönünden değerlendirilir. Dokulardan virus izolasyonlarına çalışılır ve gerekirse deneme infeksiyonu oluşturulabilir.

Kullanılmadan önce deneme hayvanlarının çok sağlıklı olmalarına, parazit, gizli infeksiyonların ve kanlarında spesifik antikorların bulunmamasına dikkat edilir.

3) Virusların ve viral substansların saptanması: Virusların saptanmasında ilk adımı, hastalardan alınan çeşitli muayene materyallerinden (sıvılar, biopsi ve otopsi materyalleri ile eküvyonlar) yapılan mikroskopik (ışık mikroskopi, elektron mikroskopi ve immun elektron mikroskopi) muayeneler oluşturur ve virus görüntülenmeye çalışılır. Bu ilk çalışmalar az çok bir fikir verebilir. Bu tür tetkiklerin bir benzeri de, hücre kültür sıvıları ve hücreler, embriyolu yumurtaya ait sıvılardan, doku ve organ parçalarından ve deneme hayvanlarından alınan çeşitli örneklerden de yapılır. Gerek ilk muayene materyallerinden ve gerekse laboratuvarda kullanılan canlı sistemlerden elde edilen sonuçlar birlikte değerlendirilir.

a) Sitolitik infeksiyonlarda: Hücre kültürlerinde bazı viruslar çok çabuk üreyerek kısa bir süre içinde (30-48 saat) CPE'ler meydana getirirler. Hücrelerde bazı morfolojik değişiklikler gözlenir. Hücreler yaşamını kaybederek yapıştığı cam veya plastik yüzeylerden ayrılır ve kültür sıvısına düşerler. Bu kültür sıvısında virus bulunacağı gibi infekte hücreler içinde de virus vardır. Kültür sıvısından ve hücrelerden yapılan boyalı preparatlarda viral partiküller, inklusiyon cisimcikleri, piknozis, dev hücreleri vs mikroskopik değişiklikler de ortaya konur.

Ayrıca, kültür sıvısından ve infekte hücrelerden elde edilen viruslardan yine canlı sistemlere ekimler yapılarak viral üreme ve titresi kontrol edilir ve oluşan bozukluklar değerlendirilir.

Virusun ürediğini veya varlığını saptamada, hemaglutinasyon, hemadsorbsiyon, interferens gibi testler yanı sıra antijen antikor ilişkilerinden de yararlanarak çeşitli konvansiyonel serolojik testler (hemaglutinasyon inhibisyon, hemadsorbsiyon inhibisyon, serum nötralizasyon, komplement fikzasyon, plak inhibisyon, lateks aglütinasyon, agar-jel diffusyon gibi) kullanılabilir. Ayrıca, daha ileri yöntemlerden olan ELISA, RIA, IFA gibi metotlardan da yararlanılabilir.Antijen-antikor reaksiyonlarından olan bu testler bilinen antikor karşısında bilinmeyen antijenin varlığını indirekt olarak ortaya koydukları gibi, bilinen antijenin varlığında, kanda oluşan antikorların ne olduğunun belirlenmesinde de aynı duyarlılıkta kullanılabilirler.

Viral antijenik maddelerin mikroskopla görüntülenmesinde kullanılan yöntemlerden immunfluoresans ve immunperoksidaz testleri yanı sıra, diğer ileri tekniklerden olan Western blotting, protein dot blot ve in situ immunperoksidaz gibi testlerden de yararlanılabilir.

b) Persistent infeksiyonlar: Bu tür infeksiyonlar da hücre kültürlerinde virus ürediği ve dışarı çıkarıldığı halde hücrelerde bir değişiklik gözlenemez. Virus hem hücre kültür sıvısında ve hem de hücreler üzerinde ve içinde bulunur. Böyle durumlarda virus, hücre sıvısından yapılan hemaglutinasyonla, hücreler yapılan hemadsorbsiyon ve infektivite interferens testleri ile ortaya konabilir. Hücre sıvısındaki virus ile infekte hücreleri içinden çıkartılan viruslar birleştirilerek elde edilen virus suspansiyonlardan indirekt yöntemler kullanarak (serolojik testler) virusun varlığını ortaya konabilir.

c) Latent infeksiyonlar: Bu infeksiyon türünde, hücreler içinde virus üremez. Ancak, viral genom hücre kromozomuna integre olur. Kromozom ile birlikte replike olur ve kardeş hücrelere de aktarılır.

Böyle durumları ortaya koymada biyoteknolojik yöntemlerden (Southern blotting, Northern blotting, dot blotting) yararlanılır.

Virus izolasyonları için kullanılan embriyolu yumurtalardan ve deneme hayvanlarda da benzer uygulamalar yapılır.

4) Spesifik antikorların saptanması (serolojik testler): İnfeksiyondan belli bir süre sonra virusa karşı vücutta oluşan spesifik antikorları saptamada çeşitli serolojik yöntemler kullanılır. Bunların hemen hepsinin temelinde antikor-antijen reaksiyonları vardır.

Kanda spesifik antikorları saptayan yöntemlerin bir kısmı, aynı zamanda antijenleri de ortaya koymada da iş görür. Serolojik reaksiyonlarda, genellikle, bilinen antijene (immunojenik substansa) karşı oluşan ve fakat bilinmeyen antikorlar ortaya konulmaktadır.

Antikorların kanda ilk ortaya çıkması ile infeksiyonun başlangıcı arasındaki inkubasyon dönemi içinde, bazı viral infeksiyonlarda sentezlenen interferonlar hücreleri infeksiyondan korurlar. Antikorlar çoğaldıkça, interferonların miktarında azalmalar ve sonunda kaybolmalar meydana gelir. İnterferonlar, özellikle, a ve b'lar virus infeksiyonlarını önlemede oldukça etkindirler ve infeksiyonun başlangıcında ilk 7-8 saatleri içinde çeşitli hücreler tarafından sentezlenirler. İnterferonlar antikor değildir ve antikor aktivitesine de sahip değildirler. İndirekt bir etki mekanizmasını gösteren interferonlar, bakteri, mantar, parazit, vs mikroorganizmalara karşı da meydana gelebilirler ve etkinlikleri de nonspesifiktir (virus türlerine özel değildir).

Vücuda bir mikroorganizma girdiğinde belli bir inkubasyon döneminden sonra ilk önce İgM'ler ortaya çıkarlar. İnfeksiyon devam ettiği veya ilerlediği durumlarda veya vücuda aynı etken belli bir süre sonra tekrar girdiğinde bu defa İgG'ler oluşmaya, yükselmeye ve uzun bir süre kanda kaldıktan sonra düşmeye başlarlar.

Bazı durumlarda (testlerde) vücutta spesifik antikora rastlanmasına karşın antijen saptanmayabilir veya bazen de vücutta antijen vardır buna karşın antikor ortaya konmayabilir. Serolojik testlerde kros reaksiyonlar, yanlış pozitiflik ve yanlış negatiflik oluşumlarına rastlanabilmektedir.

Günümüzde gerek kanda (serumda) spesifik antikorları ortaya koymada ve gerekse homolog antijenleri saptamada, duyarlılığı ve spesifitesi oldukça yüksek aletlerden ve kitlerden yararlanılmaktadır.

Serumda, İgM'lerin fazla olması akut bir infeksiyonu ve İgG'ler de ilerlemiş kronik veya sekonder infeksiyonu ortaya koyarlar. IgE'ler ise alerjik reaksiyonlarda ve parazit infeksiyonlarında kandaki miktarlarında artırmalar olur.

Kanda oluşan spesifik antikorları ortaya koymada konvansiyonel ve ileri teknikler kullanılır.

03.02. Biyoteknolojik (Moleküler) Yöntemler

Son yıllarda Mikrobiyoloji alanında hastalık ajanlarına ait nukleik asitlerin ortaya konmasını amaçlayan yöntemler, diğer klasik metotların yanı sıra oldukça yoğun olarak kullanılmaya başlanmış ve bazı durumlarda da onların daha ilerisine ulaşmış bulunmaktadır. Ancak, yöntemlerin bir kısmı, halâ rutine girememiştir. Çünkü pahalı, dışa bağımlı, özel alet-malzemeye gereksinim duyan, deneyimli personele ihtiyaç gösteren ve gelişmiş laboratuvarlarda ancak kullanabilme durumları vardır. Bu nedenle rutinde ancak bir-ikisinden yararlanılmaktadır.  

Biyoteknolojik yöntemler antikorlardan ve inaktivasyonlardan etkilenmediği gibi etken izolasyonuna, identifikasyonuna bu amaçla kullanılacak canlı sistemlere ve serolojik reaksiyonlara da ihtiyaç bulunmamaktadır. Preparatlarda etkene ait olan spesifik bir tek DNA (veya RNA) molekülünün bulunması teşhis için yeterli olabilmektedir.

Biyoteknolojik metotlarla, infeksiyöz hastalıklar da vücutta bulunan antijen ve/veya antijenik substanslar ile bunlara karşı oluşmuş spesifik antikorların değil, etkene ait olan çok spesifik bir nukleik asit segmentini hem çoğaltmak (amplifikasyon) ve hem de belirlemek amaçlanır.

Biyoteknolojik tekniklerin de bazı dezavantajları da bulunmaktadır. Şöyle ki, hiç bir spesifik klinik belirti göstermeyen, kanında antikor saptanamayan etken izolasyonu negatif olan, biyokimyasal, hematolojik, radyolojik, vs tetkiklerde ip ucu elde edilemeyen durumlarda, preparatlarda tesadüfen bir etkene ait genetik materyalin bulunması ve bunun amplifiye edilerek saptanması olgularını pozitif olarak değerlendirmek hala netlik kazanmış değildir. Hatta, kros reaksiyonlar ve kontaminasyonlar da (laboratuvardaki malzeme ve solüsyonların amplifiye olmuş nukleik asit sekansları ile bulaşması) oldukça fazla ortaya çıkmakta ve sonuçlara olumsuz yönde etkilemektedir.

Bu nedenle, bazı durumlarda bu teknikleri çok iyi kullanan referans laboratuvarlarından yararlanmak  çok daha güvenli ve ucuz olur. Ayrıca, konvansiyonel ve ileri tekniklerin iyi ve güvenilir çalıştığı olgularda, biyoteknolojik metotlar ikinci sırada düşünülebilir.

Biyoteknolojik metotlar kısaca şöyledir.

A) Prob hibridizasyon yöntemleri

1) Southern blot hibridizasyonu  
2) Northern blot hibridizasyonu  
3) Dot blot hibridizasyonu  
4) İn situ hibridizasyon

B) Target (hedef) sekans amplifikasyonu

1) Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR, PCR)  
2) Q-beta replikaz sistemi

Biyoteknolojik yöntemlerin her aşamasının çok ciddi ve titizlikle hazırlanmasının ve uygulamaya konulmasının çok büyük önemi vardır. Kullanılacak probların ve primerlerin güvenilir yerlerden temin edilmesinin büyük yararı bulunmaktadır. Ayrıca, büyük bir uğraşıyı gerektirdiği gibi bir ekip işi ve zaman alıcı olduğunu da unutmamak gerekir.  

04. Viral  Antijenlerin  ve  Viral  Antikorların Saptanmasında Kullanılan  Başlıca  Serolojik Yöntemler

Viral infeksiyonların tanısında kuşkusuz serolojik yöntemlerin çok büyük değeri vardır. Serolojik metotlar hem bilinmeyen antijenlerin ve hem de antikorların saptanmasında kullanılabilirler. Şöyle ki, izole edilen bir etkenin ne olduğunu belirlemede elde mevcut olan ve bilinen spesifik pozitif serumlardan yararlanılacağı gibi, şüpheli bir olgudan elde edilen bilinmeyen bir serumun da, bilinen antijenle (homolog antijen) reaksiyona konulması, indirekt etiyolojik teşhis için önemlidir.

Serolojik reaksiyonlarda bir çok şüpheli durumlar meydana gelebilmektedir. Örn, yanlış pozitif ve yanlış negatif reaksiyonlar ve kros reaksiyonlar çoğu zaman ortaya çıkmakta ve sonuçları yanıltmaktadır. Bir çok infeksiyon türlerinde de gizli, perakut ve çok erken dönemlerde de antikor oluşumuna rastlanamadığı gibi immun yetmezliği olan ve immun supresif kişilerde de antikor oluşumu genellikle zayıftır veya yoktur.

Testler de kullanılacak serumların taze olması  kontamine, bayat, oda ısısında bekletilmiş, birkaç kez dondurulup çözülmüş olmaması çok önemlidir.

Bu konu içinde adı geçen serolojik testler aşağıda özetle bildirilmiştir.

04.01. Nötralizasyon Testi

Vücuda giren infeksiyöz ajanlarına karşı oluşan ve bunların infektivitesini veya infeksiyon yapma yeteneğini ortadan kaldıran antikorlar meydana gelir ki böyle olguya nötralizasyon adı verilir. Test sadece viruslara özgü olmayıp toksin ve enzimler için de uygulanabilir. Nötralizan antikorların ortaya konmasında hücre kültürleri ve embriyolu yumurtalardan fazlaca yararlanılır. Hücrelerde CPE yapan veya embriyolu yumurtalarda ölümler oluşturan viruslar, kendine karşı oluşmuş antiviral antikorla oda ısısında 30-40 dk. tutulduktan sonra, canlı sistemlere ekildiğinde hücrelerde CPE'ler ve embriyolarda ölümler görülmez (nötralizasyon pozitif) veya bu olgularda, antikorun miktarına göre değişik derecede azalmalar görülür.

Nötralizasyon testi hem antijenlerin (virusların) ve hem de spesifik nötralizan antikorların belirlenmesinde kullanılabilir.

Nötralizasyon reaksiyonundan deneme hayvanlarında proteksiyon testi olarak ta yararlanılabilir. Virusların ve antikorların nötralizasyon testi ile infektif titreleri (%50) ve nötralizan titreleri (%50) saptanabilir.

Plak nötralizasyon ve redüksiyon testi: Hücrelerde üreyerek CPE yapan virusların çoğu, besleyici agarla kaplanan hücrelerde plaklar (CPE odakları) oluşturur. Eğer virus, kendine, karşı oluşmuş antiviral homolog antikorlarla karıştırıldıktan ve oda ısısında 30-40 dk. bekletildikten sonra monolayer hücreler üzerine ekilir ve bir süre sonra hücreler besleyici agarla kaplanmışsa, hücrelerde ya hiç plak oluşmaz (plak nötralizasyonu) veya plak sayısında azalmalar olur (plak redüksiyonu). Plak sayısında %50 ve fazla olan azalmalar redüksiyon pozitif olarak değerlendirilir. Kontrol hücrelerle karşılaştırması yapılır.

Eğer virus homolog antikor taşımayan bir serumla veya başka bir serumla karşılaştırılıp ekilirse, nötralizasyon olmayacağından, plak formasyonu görülür.

04.02. Lateks Aglütinasyonu

Bu test de, hem antikorları veya hem de antijenleri belirlemede kullanılabilir. Lateks partikülleri (0,80 mm çapında, polistern) immunojenik moleküllerle kaplandığında, kandaki antikorları saptamada veya eğer lateks partikülleri spesifik antikorlarla kaplanırsa virusları (antijenleri) belirlemede kullanılır. Her ikisinde de pozitif olgularda aglütinasyon meydana gelir ve lateks partikülleri kümeleşirler (lateks aglütinasyonu). Antijenin, homolog antiserumla birleşemediği durumlarda, aglütinasyon meydana gelmez.

04.03. Hemadsorbsiyon-İnhibisyon Testi

Hücrelerde üremesine ve dışarı çıkmasına karşın, CPE oluşturmayan fakat hemaglutinin oluşturan virusların varlığını saptamada kullanılan bir serolojik testtir. Eğer, hücreler üzerine homolog viral antiserum konulduktan bir süre sonra alyuvarlar ilave edilirse, hücrelerdeki virus nötralize olacağından alyuvarlar  hücrelere bağlanamazlar ve hemadsorbsiyon olayı görülmez (hemadsorbsiyon-inhibisyon pozitif). Eğer, serum negatifse, virus nötralize olmaz ve ilave edilen alyuvarların hücreler üzerinde kümeler oluşturmasına yol açar (hemadsorbsiyon-inhibisyon negatif). Reaksiyon mikroskop altında değerlendirilir.

Sadece, hemadsorbsiyon testi, serolojik bir reaksiyon değildir (çünkü serum kullanılmaz) ve hücrelerde virusun varlığını ortaya koyar. Eğer hücrelerde hemaglutinin oluşturan bir virus varsa, alyuvarlar ilave edildiğinde hücreler üzerindeki viruslara bağlanarak kümeler oluşturur (hemadsorbsiyon pozitif). Mikroskop altında kolayca gözlenebilir.

04.04. Hemaglutinasyon (HA) ve Hemaglutinasyon İnhibisyon (HI) Testi

04.05. Paul-Bunnel Testi

İnsanların viral (Epstein-Barr virusu) bir hastalığı olan infeksiyöz mononukleozisde hastaların yaklaşık %50-80'inin serumu, koyun alyuvarlarını aglutine eder. Bu reaksiyon bir antijen antikor reaksiyondur.

04.06. İmmunfluoresans Antikor (IFA) Testi

Bir antijen-antikor reaksiyonu olan bu testte, spesifik antikorlar fluorokrom bir boya (FITC, Auramine, Rhodamin, vs) ile boyanmıştır. Bir preparatta homolog antijenin bulunduğu durumlarda üzerine boyalı antikor konursa, boyalı antikorlar antijenle birleşir ve UV-ışınları ile donatılmış mikroskop altında sarı-yeşil parlak bir fluoresans vererek kolayca fark edilirler. Bu test iki tarzda uygulanabilir.

Direkt İFA testinde, şüpheli antijeni taşıyan materyal sıvı (hücre kültürü, vs) temiz lâm üzerine yayılır ve asetonla fikse edilir. Bunun üzerine, FITC (fluorescein isothiocyanate) ile boyalı bilinen antikorlar konulur. Bir süre bekletildikten sonra yıkanır, kurutulur ve UV-ışınları altında mikroskopta incelenir. Eğer preparat üzerinde homolog antijen varsa, boyalı antikorla birleşerek mikroskop altında parıltılı olarak görülecektir (pozitif reaksiyon). Antijen yoksa veya başka bir etken varsa böyle bir birleşme olmayacak, boyalı antikor yıkanma sırasında giderileceğinden mikroskop altında parıltı görülmeyecektir (negatif reaksiyon).

İndirekt İFA testinde ise, temiz bir lâm üzerine bilinen antijen konarak fikse edilir. Üzerine şüpheli serum ilave edilerek bir süre bekletilir ve yıkanır. Kuruduktan sonra, lâm üzerine, FITC ile boyanmış antiglobulin (antihuman, antibovine, vs) ilave edildikten bir süre sonra yıkanır ve kurutulur. Mikroskop altında muayene edilir. Eğer, şüpheli (boyasız, birinci serum) serumda lâmdaki antijene karşı homolog antikor varsa, antijenle birleşir ve preparat üzerinde kalır. Yıkanınca gitmez. Bunun üzerine boyalı antikor konduğunda, bu ikinci antikor kompleksle birleşerek mikroskop altında sarı yeşil bir parlaklık gösterir (pozitif reaksiyon). Eğer, şüpheli serum da (ilk serum) antikor yoksa (veya serum başka bir etkene ait ise), lâm üzerinde birleşme olmaz ve boyalı antikorda bağlanamayacağından, mikroskop altında fluoresans gözlenemez (negatif reaksiyon).

04.07. Radioimmunassay (RIA)

Antikor veya antijen aramada yararlanılan bu test de, ELISA'nın bir benzeridir. Ancak, bu testte, immunglobulinler (antihuman, antibovine, vs) radyoaktif maddelerle (radioisotoplar 14C, 125I, vs) konjuge edilmiştir. Pozitif reaksiyonlar da, antijenle antikor birleştiğinde meydana gelen immun kompleks bir radyoaktivite kazanır. Bu da özel sayıcılarla (gama sayıcısı detektör gibi) saptanır. Belirlenen radyo aktivitenin derecesi ölçülür. Negatif olgularda, bir radyoaktivite tespit edilemez.

Kompetatif RIA'da ise saptanan maddelerin miktarı da belirlenebilir.

04.08. Enzyme Linked İmmunosorbent Assay (ELISA)

Böyle testler Enzyme immunoassay (EIA) olarak ta tanınırlar. Çok kullanılan, duyarlı ve spesifik bir testtir. Bunun için çok geliştirilmiş aletler bulunmaktadır. Bu testte yukardakilerin (IFA, RIA) diğer bir benzeridir. Burada ikinci antikor bir enzimle (horse redish peroksidase) ile işaretlenmiştir. Ortama katılan kromojen substrat, pozitif olgularda renk meydana getirir ve buna göre değerlendirme (kolorimetrik olarak) yapılır. ELISA ile hem antikor ve hem de antijen aranabilir.

Antikor aranmasında, bilinen antijen plastik yüzeylere (plastik boncuk, plastik tüp, vs) adsorbe edilir. Bunun üzerine şüpheli serum konur. Bir süre sonra yıkanır. Bu defa enzimle işaretle antiglobulin (antihuman, anti bovine, vs) ilave edilir. Bir süre sonra bu da yıkanır ve sonra enzime uygun kromojen substrat katılır. Bekletilir ve yıkanır. Eğer, şüpheli serum (ilk serum), antijene ait homolog antikor taşıyorsa, plastik yüzeyde bir antijen-antikor kompleksi oluşur. Bu kompleks, preparat yıkanınca plastik yüzeyden gitmez. Bunun üzerine, enzimle işaretli ikinci antikor konulunca, bu antikorlar kompleksle birleşir. Bunlar da kompleks üzerinde kalırlar. Enson ilave edilen kromojen substrat, enzimle reaksiyona girerek renk meydana getirir ve bu renk kolorimetrik olarak değerlendirilir (pozitif reaksiyon). Negatif olguda renk meydana gelmez.

Kromojen substratlar, kullanılan enzime göre değişebilir. Şöyle ki, peroksidaz için 5-aminosalisilikasit, alkalen fosfataz için ise 4-nitrofenil fosfat kullanılır.

Bazı testler de, enzim yerine stafilokok S. aureus 'un  protein A'sından da yararlanılabilir. Bu proteinin antikorların Fc-porsiyonlarına bağlanma özelliği vardır.

Antijen aranmasında, bu defa plastik yüzeylere bilinen antikor adsorbe edilir. Bunun üzerine şüpheli (bilinmeyen) antijen konur. Bir süre beklenir ve yıkanır. Sonra, bilinen (aranan), antijene karşı elde edilmiş ve enzimle işaretli antikor ilave edilir. Beklenir ve yıkanır. Sonra enzime uygun kromojen substrat eklenir, bir süre sonra yıkanır. Oluşan renke göre bir değerlendirme yapılır. Bu test de, eğer şüpheli materyal içinde, plastik yüzeye bağlanmış olan antikorlar için homolog antijen varsa, bunlar antikorlar için birleşir ve bir immun kompleks oluşur. Sonradan katılan ve antijene karşı oluşturulmuş ve enzimle bağlanmış spesifik antikor da, bu kompleksteki antijene bağlanır. En son katılan kromojen substratta komplekste var olan enzimle reaksiyona girerek renk verir ve kolorimetrik olarak değerlendirilir (pozitif reaksiyon). Negatif olguda (yani antijen yok veya homolog değilse) renk meydana gelmez. Çünkü, immun kompleks oluşmadığından enzimle işaretli ve antijene spesifik antikor da birleşemez, yıkanınca giderilir. Ortamda enzim olmayınca, substrat reaksiyona giremez aynen kalır ve bu da yıkanınca plastikten çıkar. Böylece renk oluşamaz.

04.09. Komplement Fikzasyon (KF) Testi

Tarihsel bir değeri olan oldukça sensitif ve komplike bir reaksiyondur. Günümüzde orijinal veya modifiye olmuş alternatifleri vardır.

Kandaki spesifik antikorların veya bilinmeyen antijenlerin saptanması amacıyla az da olsa kullanılabilir. Bu testte, önce tüplere şüphelenilen serum (titre edilir), sonra bilinen antijen (titre edilmiş) ve bir süre sonra da komplement (taze kobay serumu, çalışır titre de) konur, iyice karıştırılır ve 37°C de 30 dk bekletilir. Bu aşamada, şüpheli serum içinde, antijene karşı homolog antikor varsa antijenle birleşir ve komplement te bu komplekse bağlanır. Eğer, antikor yoksa antijenle birleşme olmaz ve komplement te bağlanamaz ve serbest kalır. Bu birinci aşamada, komplementin bağlandığını veya bağlanmadığını anlamak için, tüplere, hemolitik sistem olarak adlandırılan (hemolitik serum + koyun alyuvarları) bir karışım ilave edilir, tüpler iyice karıştırılır ve yine 37°C'de 30 dk induke edilir. Bu sürenin sonunda, alyuvarlarda erime yoksa, komplement birinci aşamada, yani antikor-antijen kompleksinde tutulmuştur. Bu durum şüpheli serumda antikorun varlığını gösterir (pozitif reaksiyon). Eğer, hemoliz varsa, komplement, birinci reaksiyonda tutulamamış ve serbest kalan komplement hemolitik  serumun alyuvarlarını eritmesine yol açmıştır (negatif reaksiyon).

Bu testte, komplementin önemli rolü olduğundan teste çok iyi titre edilerek katılması ve fazla konulmaması önemlidir. Ayrıca, bazı serumlar ortamda antijen olmadan da komplementi bağlama özelliğine sahip olabilirler (antikomplementer serumlar). Bu nedenle, testte serumların bu özelliklerini belirlemek için kontrol tüpler kullanılır.

Bu test ile bilinmeyen antijenlerin saptanması da yapılabilir. Sonuç aynı tarzda değerlendirilir.

04.10. Agar Gel İmmundifusyon (AGİD)

AGİD'nin diğer testlere oranla duyarlılığı daha azdır ve bu nedenle de pek fazla tercih edilmemektedir (özel çalışmalar hariç). Testin birkaç alternatifi de bulunmaktadır. Bunlar arasında jel de tek yönlü diffusyon (Oudin yöntemi), jel de çift yönlü diffusyon (Ochterlony yöntemi), tek yönlü radial diffusyon (Mancini yöntemi) ve karşıt immun elektroforez tekniği (jel içinde elektriksel bir ortamda antijen ve antikorların karşılıklı yayılımı).

Oudin tekniğinde küçük bir tüp içine, yumuşak agar (jelatinde olabilir) ile karıştırılmış antiserum konur ve katılaşması beklenir ve sonra üzerine ince bir  katman oluşturacak tarzda sıvı antijen konur ve 37°C de rutubetli etüve bırakılır. Bir-iki gün içinde üstteki sıvı antijen yumuşak agara diffuse olur ve buradaki homolog antikorla birleşerek yüzeyden biraz aşağıda beyaz bir halka oluşturur (eğer antijen ve antikor uygun yoğunluklarda ise) (Presipitasyon pozitif). Negatif olgularda antijen, agardaki antikorla homolog değilse, bağlanma olmaz ve halka meydana gelmez.

Ochterlony yönteminde, petri kutularında hazırlanan yarı katı agar, ortada açılan bir çukura bilinen antiserum (veya bilinen antijen) konur. Ortadaki bu deliğin etrafında da 0,5-10 mm uzaklıklarda 4-5 tane aynı çapta delikler açılır. Eğer, ortaya bilinen antiserum konmuşsa, dıştaki deliklere şüpheli bilinmeyen antijenler konur veya ortaya bilinen antijen konursa, etraftaki deliklere antiserumlar (şüpheli) ilave edilir. Test hazırlandıktan sonra, 37°C'de 1-2 gün bekletilir. Burada, gerek ortadaki ve gerekse etraftaki deliklerde bulunan sıvılardan agar içine karşılıklı difüsyon olacağından antijenle antikorun birleştiği yerlerde, orta delikle yanlardakilerin arasında beyaz bir çizgi (bazen iki çizgi) meydana gelir (pozitif reaksiyon). Negatif olgularda dıştaki deliklerden biri veya diğerleri ile orta delik arasındaki yerde presipitasyon çizgisi oluşmaz (negatif reaksiyon).

Manchini tekniğinde ise, yumuşak bir agarla homojen olarak karıştırılmış antiserum temiz bir lâm (veya plak) üzerine konur ve katılaşması beklenir. Sonra, üzerinde, küçük delikler açılarak (delikler eşit aralıkla açılır ve çaplarının aynı ölçüde olmasına dikkat edilir) bunların her birine farklı antijen (veya bir antijenin çeşitli dilusyonları) konur. Sonra, lâm 37°C rutubetli etüve bırakılır. Delikler etrafında dairesel beyaz halkanın  oluşması pozitif olarak değerlendirilir. Deliklerin etrafındaki dairelerin çapı, antijenin konsantrasyonu ile ilgilidir.

Karşıt immunelektroforeziste de jel kullanıldığından benzer işlemler yapılır. Ancak, antijen ve antikorun difüsyonu elektriksel ortamda gerçekleşir. Bu teknikte de jelin bir ucunda açılan çukura antijen ve jelin diğer ucundaki çukura da antiserum yerleştirilir. Antijen tarafına negatif elektrod ve antiserum tarafına da pozitif elektrod bağlanarak uygun voltajda elektrik cereyanı verilir. Antijenler pozitif uca ve antikorlar da negatif uca doğru giderken karşılaştıkları yerde birleşerek beyaz çizgi oluştururlar (pozitif reaksiyon).

04.11. İnfektivite İnterferens Testi

Bazı viruslar hücrelerde ürediklerinde, diğer virusların aynı hücrelerde üremesini inhibe etmesi üzerine dayanan bir testtir. Bu test özellikle, hücrelerde ürediği halde CPE yapmayan virusları belirlemede kullanılır. Eğer hücrelerde CPE yapmayan bir virus varsa (veya üremişse) bu hücreler, aynı hücrelerde CPE yapan ikinci başka tür virusun üremesine ve CPE yapmasına mani olacağından, hücrelerde CPE yapmayan bir virusun ürediği (varlığı) anlaşılır. Eğer hücrelerde önceden üremiş bir virus yoksa, ikinci virus çoğalarak CPE meydana getirir.

04.12. İmmunperoksidaz Testi

Bir antijen antikor reaksiyonu olan bu teknikten, dokularda bulunan antijenik substansları ve inklusiyon cisimciklerini belirlemede yararlanılır. Direkt ve indirekt olarak uygulanır. Mikroskop altında değerlendirilir.

Direkt test te, bir lâm üzerine konan doku kesitlerine peroksidaz ile işaretli spesifik antikorlar ilave edilir ve sonra da substrat konur. Eğer dokuda antijen varsa, antikorla birleşerek kompleks oluşur ve enzim de doku üzerinde kalır. Substrat katıldığında enzimle reaksiyona girerek, dokulardaki antijenin bulunduğu yerlerde koyu kahve renk meydana gelir ve bu renk ışık mikroskobu altında kolayca görülür. İndirekt testte ise, doku kesitleri üzerine sıra ile spesifik antikorlar, peroksidaz ile işaretli anti-İgG'ler ve sonra da enzim subsratı katılır. Pozitif olguda, mikroskop altında, doku üzerinde kahve renkli odaklar görülür.

[1] Kaynak : Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 43267 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader