Mantar Kültürlerinin Muayeneleri

Mantar Kültürlerin  Muayeneleri  

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji1

01. Kutan Mikozesler 
   01.01. Koloni Makromorfolojisi 
   01.02. Koloni Mikromorfolojisi  
02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler
 
   02.01. Koloni Makromorfolojisi 
   02.02. Koloni Mikromorfolojisi  

01. Kutan Mikozesler

Uygun bir süre ve ısıda tutulan saf kültürlerin incelenmesinde, genellikle, aşağıdaki sıra izlenir:                                                                                                                                         

01.01. Kolonilerin Makromorfolojisi

Dermatofitlerin identifikasyonunda kolonilerin makromorfolojilerinin incelenmesi önemli yer tutar. Bu muayenede, üreyen saf mantar kolonileri, morfolojik olarak çeşitli yönlerden tetkike tabi tutulur. Bunlar da;

1- Üreme durumu: Kolonilerin gelişme durumu çaplarının ölçülmesi ile saptanır. Üreme durumu inkubasyon ısısı, süresi, besi yerinin bileşimi ve miktarı ile ilişkili olması yanı sıra, türlerinin kendine özgü bir gelişme kapasitesine de bağlıdır.Ayrıca, ilk izolasyonlarda yavaş bir üreme gösteren ve küçük koloni çapına sahip olan bazı mantarlar, pasajları yapıldıktan sonra daha çabuk üreme yeteneği kazanabilirler.

Bazı mantarlar  (M. canis, M. gypseum) genellikle çabuk ürer ve 10-13 gün içinde koloni çapı 3-4. cm. büyüklüğe ulaşır. Buna karşılık T. verrucosum ve T. violaceum daha yavaş ürer ve aynı süre içinde 1.0-1.5cm. kadar olur. T. schonleinii, T. soudanse, T. yaoundei, ilk pasajda bile çok yavaş ürer ve 20 gün sonra olgunlaşır. T. gallinae, E. floccosum, M. ferrugineum ise ancak, 15 günden sonra olgunlaşır. Bu olgunlaşma dönemi mantarların teşhisine yarayacak en iyi periyoddur.

Bazı mantarlar da laboratuarlarda, devamlı pasajlar sonu, mutasyona (kromozomal değişmelere) uğrayarak koloni görünümünde bazı değişmeler meydana gelir. Böyle kolonileri teşhis etmek oldukça güçtür. T. audouinii ve T. megninii kültürleri, diğerlerine oranla daha sabit bir karaktere sahiptirler.

2- Koloni şekli: Dermatofit kolonilerinin şekli, genellikle, yuvarlak veya ovaldir. Bazılarının kenarları loblu, çentikli, asteroid, vs. olmasına karşın, bir kısmının da düzdür. Ancak, bu görünümler varyasyonlar sonucu değiştiğinden, türlere özgü bir sabit karakter göstermezler ve bu nedenle de kolonilerin identifikasyonunda, koloni şekli yanı sıra, diğer özelliklere daha fazla önem verilir. Aşağıdaki çizelgede, dermatofitlerin koloni morfolojileri gösterilmiştir.

3- Koloni topografisi: Dermatofit mantarlarının koloni topografisi çok değişiklik gösterir. Koloniler, genellikle, yassı ve hafifçe kabarık bazılarının ortası belirgin şekilde çıkıntılı, bazı dermatofitler de, merkezden yanlara doğru sathi veya derince çizgili, katlı, bazılarının üzeri düzensiz kıvrımlı ve kırışıktır.

4- Koloni yapısı: Dermatofitler başlıca, 4 koloni yapı karakteri gösterirler:

a) Maya-benzeri yapı: Bu özellikteki koloni yapısına, Candida türlerinde ve dimorfik mantarların (Blastomyces, Coccidioidomyces, Histoplasma, vs.) 37 oC'de üreyen kolonilerinde rastlanır. Bu tarz koloniler kabarık, kenarları yuvarlak, oval veya düzensiz, mukoid karakterdedirler ve hifalara rastlanmaz.

b) Flamentöz yapı: Böyle koloniler, pamuk veya kadife gibi tüylü bir görünüme sahiptirler. Aerial hifalardan oluşan bu yapıda, sporulasyona veya konidioforlara fazlaca rastlanmaz.

c) Granüler yapı: Aerial hifaların az bulunduğu veya görülmediği bu dönemde sporulasyona fazlaca rastlanır. Bu yapı özelliği koloniler olgunlaştıktan sonra meydana gelir. Kolonilerin üzeri ince granüler bir görünümdedir. Bazen aynı kolonilerin bir bölgesi (daha ziyade orta kısmı) granüler bir yapı gösterirken, kenarları flamentöz bir özelliğe sahip olabilmektedir.

d) Tüysüz membranöz yapı: Bu koloni yapısında, tüysüz deri gibi bir görünüm vardır. Ancak, koloni kenarlarında hifalara rastlanabilir.

5- Koloni rengi (üstten): Koloniler olgunlaştıktan sonra yüzeyde görülen renk bazen tek ve bazen de birçok renklerin kombinasyonu halinde bulunabilir. Bazı dermatofitler de, ortama yayılabilen pigmentler meydana getirebilirler. Mantarların renk oluşturması bir genetik karakter olmakla beraber, ortamın yapısı ve pH’sı ile de ilişkilidir. T. mentagrophytes, T. rubrum ve T. violaceum ’un pigmentleri antrakinon yapısındadır. Dermatofitler açıktan koyu renge kadar değişebilen kanarya sarısı, limon sarısı, portakal rengi, açık kırmızı, koyu kırmızı, kahverenginin çeşitli tonları, siyah, menekşe rengi, vs.), bir renk skalasına sahiptirler.

Koloni rengi (alttan): Bazı dermatofitlerin (T. gallinae, T. megninii, vs) koloni arka yüzünün pigmentasyonu ile karakterize olmaktadırlar. Bazen de koloninin üstten görünümü ile alttan görünümü ayrı renk tonundadır (E. floccosum, T. violaceum, vs.). Dermatofitlerin arka yüzü görünümü de çok çeşitli renkler (sarı, oranj, kırmızı, kahverengi, yeşilimsi ve renklerin açık ve koyu formları) gösterirler. Arka yüz rengi koloni identifikasyonunda daha fazla işe yaramaktadır.

6- Pleomorfizm: Granüler veya membranöz karakterdeki kolonilerin, genellikle, orta kısımlarında bazen de kenarlara yakın yerlerinde, beyaz pamuk veya tüy gibi oluşumlara rastlanır. Bunlar steril hifaların oluşturduğu topluluklardır (pleomorfizm veya pleomorfik dejenerasyon). Bazı hallerde, pleomorfizm, bütün koloniyi kaplayabilir. Böyle durumlarda, mantar, orijinal makro-ve mikrokoloni morfolojisini ve pigmentasyon yeteneğini kaybeder. Dejenerasyonun ilk başlangıçında makrokonidiumlar, sonra da mikrokonidiumlar ve bununla beraber diğer strüktürler gelişemezler veya oluşamazlar. Koloni sadece miselyum halinde kalır. Bu değişmelere, fizyolojik ve biyokimyasal varyasyonlar da katılır. Pleomorfik dermatofit şuşları, orijinallerinden daha fazla nitrojenli madde kullanırlar. Pleomorfizm, daha ziyade, kültürlerde spontan mutasyonlar sonucu meydana gelir ve pasajlar bu durumu kolaylaştırırlar.

Bazı hallerde, lezyonlardan ilk izole edilen mantar kolonilerinde de pleomorfik dejenerasyonlar görülebilir. Böyle mantarları pasaj etmek ve identifikasyonunu sağlamak olanak dışıdır. Eğer koloni tam pleomorfik değilse, ancak, bir kaç pasajdan sonra sporulasyon görülebilir. Böyle durumlarda, özel sporulasyon ortamları (patates dekstroz agar, vs. gibi) kullanmak iyi bir tedbir olur. Tam pleomorfizm oluşmuşsa, bunu geriye, sporlu formuna döndürmek çok zordur veya imkansızdır.

Pleormorfik dejenerasyon pasajlarla arttığından, bunu laboratuarlarda önlemek için, her 10-15 gün içinde (veya mantarın olgunlaştığı dönemde) subkültür yapılır. Bu amaçla, inokulumlar, normal görülen koloni bölgelerinden seçilmelidir. Ayrıca pleomorfizme mani olmak için, mantarlar, -20oveya -60oC'de muhafaza edilebilirler.

7- Faviform dejenerasyon: Bazı mantarların orijinal tüylü veya kadife gibi olan kolonilerinin kenarları, tüysüz membranöz bir durum gösterir. Bu tarz değişikliğe ƒaviform dejenerasyon adı verilmektedir. T. rubrum kolonilerinde bazen, ve T. violaceum'da da, genellikle, kolonilerin ilk başlangıçında bu tarzda oluşumlarına rastlanabilir.

01.02. Kolonilerin Mikromorfolojisi

Dermatofitlerin makromorfolojik karakterleri, kolonilerin birbirlerine bir çok yönden benzemeleri sonu, identifikasyonda önemli ip uçları verememektedir. Bu nedenle mikroskop altında muayene edilmeleri ve türlere ait bazı özelliklerin saptanması gereklidir. Kolonilerin mikromorfolojisi başlıca iki tarzda saptanabilir.

1- Tüm koloninin, stereoskopik mikroskop altında ve küçük büyütme ile muayene edilmesi, genellikle, mantarların identifikasyonuna pek yararlı bilgi vermemekle beraber, koloni hakkında kabaca bir fikir edinilmesi bakımından önem taşır. Bu muayenede, koloninin şekli, topografisi, yapısı ve dejenerasyonlarına ait bazı bilgiler elde edilebilir.

2- Üremiş kolonilerin çeşitli yerlerinden alınan materyallerden, tekniğine uyularak, boyalı veya boyasız preparatlar hazırlanarak 200 X veya 500 X büyütme ile (veya gerekiyorsa daha fazla büyüterek) mikroskop altında muayene edilir ve koloninin mikroskopik yapısı incelenir. Bu muayenede, hifalar, makrokonidium, mikrokonidium ve mikroskop altında görülebilen ve mantara ait diğer yapılar (klamidospor, artrospor, blastospor, v.s.) iyice incelenirler.

a) Hifalar: Mantarların hifa durumuna ve yapısına bakarak teşhis konulamaz. Çünkü, bu oluşumlar çok değişkendir ve çok değişiklikler gösterirler. Dermatofitlerin hifaları septumlarla bölünmüş olup branşlıdırlar. Bazı mantarlardan (M. ferrugineum, T. tonsurans) hifaların yanlarından küçük veya kısa dallanmalar görülebilir (pektinate hifa). Favik şamdanı adı verilen hifa tarzına, M. distortum, M. ferrugineum,T. concentricum, T. schoenleinii, T. verrucosum ve T. violaceum kolonilerinde rastlanabilir. T. mentagrophytes’de, özellikle, spiral hifa oluşumuna tesadüf edilir. Bazı dermatofitlerde de noduler yapı  bulunabilir. Bunların yanı sıra raket hifa, formlarına da bazı dermatofit mantarlarında rastlanabilir.

Yandaki şekilde hifa türleri gösterilmektedir.

b) Mikrokonidiumlar (microconidiae) : Dermatofitlerin önemli ve tek hücreden oluşan reprodüktif elementlerinden birisi de mikrokonidiumlarıdır (microaleuriospor). Bunlar, çok sayıda, az veya hiç bulunmayabilirler. E. floccosum, T. concentricum, M. ferrugineum ve T. schoenleinii, genellikle, mikrokonidium oluşturmazlar. Mikrokonidiumların hifa üzerinde veya serbest olarak, morfolojik yapılarının ve dizilişlerinin, mantarların identifikasyonunda rolleri pek azdır. Ancak, M. persicolor, T. mentagrophytes, T. tonsurans, T. rubrum, T. terrestre, T. georgiae, gibi dermatofitlerde, mikroaleuriosporların şeklinden yararlar sağlanabilir. Biçim bakımından, genellikle oval, yuvarlak ve armut görünümündedirler. Hifalardan tek tek çıktıkları gibi bazen toplu olarak da bulunabilirler.

Uygun koşullar altında, mikrokonidiumlardan, bir veya birkaç tane jerm tüpü oluşur, bunlardan hifalar ve sonra da miselyumlar meydana gelir.

c) Makrokonidiumlar (macroconidiae) : Dermatofitlerin mikroskopik morfolojilerinin incelenmesinde, üzerinde durulması ve iyice gözlenmesi gereken reprodüktif elementlerin başında makrokanidiumlar (macroaleuriospor) gelmektedir. Bu oluşum, bazen çok fazla, bazen de az veya hiç bulunmayabilir.

M. ferrugineum, T. concentricum, T. soudanese, T. ycoundei, genellikle, makrokonidium oluşturmazlar. Diğer dermatofitler de az veya çok sayıda (M. canis,M. cookei, M. gypseum, M. nanum v.s.) makrokonidium meydana getirirler. Bunların mikroskop altında, şekli, büyüklüğü, içindeki hücre sayısı, kenarlarının durumu ve diğer özellikleri çok iyi incelenmelidir. Şekilleri, daha ziyade, mekik, puro, kayık, lobut, yumurta görünümünde ve uçları sivri veya hafifçe yuvarlakçadır. Bazıları orta eksene göre bükülmüş (M. distortum) olmasına karşın diğer mantarların ki, genellikle, düzdür. Boyutları, mantar türlerine göre değişmek üzere, 6-20 x 30-150 mikrometre arasındadır. T. gallinae, M. persicolor, M. audouinii ve M. vanbreuseghemi 'nin makrokondium  hücre duvarları ince olmasına karşın, M. canis ’in kalındır. Bazılarının kenarlarında da özel dikensi çıkıntılar bulunur.

Makrokonidiumlar birden fazla hücreye sahiptirler. Hücreler, birer septumla birbirlerinden ayrılmışlardır. Bunların sayıları, M. nanum ve E. floccosum ’da genellikle 2-3 tane olmasına karşın, diğerlerinde 4-12 arasında değişebilir. Hücre sayıları türler için önemli bir ayırıcı karakter taşımazlar. Ancak, M. nanum’da oval veya yumurta biçiminde olan makrokonidiumlarda 2-3 taneden fazla hücre bulunmaz. E. floccosum ’da benzer yapı özelliği gösterir.

Mikroskopik preparatlarda kullanılan solüsyonların, makrokonidiumların morfolojik karakteri üzerine etkisi vardır. Bu nedenle, bazı araştırıcılar fazla değişiklik yapmaması ve çabuk öldürmesi bakımından Lugol solusyonunu (veya iyot sol.) uygun bulmaktadırlar. Ancak, muayenelerin 10-30 dakika içinde bitirilmesi gereklidir. Bu süre, lugol solusyonunun etkilemesi için yeterli bulunmaktadır. Fizyolojik suyun kullanıldığı hallerde, makrokonidiumların yapısını iyice görmek olanaksızdır. Lugol solusyonu, sporun hücre duvarını, genellikle,10-15 dakika içinde kalınlaştırır. Bu kalınlaşma, standart ve her tarafta aynı olduğu için, herhangi bir sakınca yaratmaz.

Aynı mantara ait aynı koloni içinde oluşan makrokonidiumlar morfolojik olarak bir örneklik göstermeyebilirler. Bu nedenle de sadece makrokonidiuma dayalı teşhis sakıncalıdır. Bu konuda M. cookei üzerinde yapılan araştırmalar, özetle, aşağıdaki gibidir.

- Aynı koloninin çeşitli yerlerinden yapılan preparatlarda, birbirinden önemli derecede ayrı mikroskopik görünümde, makrokonidiumlara rastlanmaktadır.

- Aynı koloninin ortasından aynı uzaklıktaki çeşitli yerlerden 12-41 gün sonra yapılan preparatlarda, makrokonidiumların uzunluk ve genişliği önemli derecede farklar göstermektedir.

- Makrokonidiumların ortalama uzunluğu, 41 günlük kolonide, merkezden (koloninin ortasından) uzaklaştıkça azalmaktadır.

- Preparatta rastlanılan makrokonidium sayısı, koloninin yaşı, preparat için örneğin alındığı yer  ve besi yerinin, makrokonidiumun genişliği ve hücre duvarı kalınlığı üzerine, diğer değişiklikler kadar, büyük oranda etkilememektedir.

- Makrokonidiumlardaki hücre sayısı, koloni yaşlandıkça artmakta ve aynı zamanda, preparat yapmak için alınan örneğin yerine göre değişmektedir.

Yukarıda bildirilen durumlar, makrokonidiumların morfolojileri, sayıları, kalınlığı ve içlerindeki hücre sayısını etkilediğinden, teşhiste çok dikkatli bulunmak gereklidir.

Uygun koşullar altında, makrokonidiumlardan bir veya birden fazla jerm tüpü meydana gelebilir. Bu gelişerek hifayı oluşturur.

Bazı dermatofitlerin makrokonidium sayısı,  boyutları ve şekilleri bahsin sonunda çizelgelerde gösterilmiştir.

d) Klamidosporlar (chlamydospor): Bazı dermatofit mantarlarında, preparatlarda, klamidosporlara rastlamak mümkündür. Bu sporlar, hifalarda bulunan hücrelerin genişlemesi, büyümesi ve kenarlarının kalınlaşması sonu meydana gelirler. Hifaların ucunda (terminal) veya yanlarında (lateral) bulunurlar. Bazen, hifada bulunan hücrelerin arka arkaya klamidospor haline dönüşmesi, tesbih gibi bir görünüm meydana getirir. Bu tarz oluşuma, T. verrucosum’da tür özelliği olarak rastlanır ve identifikasyonda çok yararlı olur.

e) Artrosporlar (arthrospor): Bu tür sporlara in vitro pek rastlanamaz. Bu sporları daha ziyade lezyonlardan yapılan preparatlarda görmek mümkündür. 

f) Blastosporlar: Bazı mantar hifalarında çeşitli yerlerde gruplar halinde yuvarlak veya oval şekilde blastosporlara rastlanabilir.

02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler

Subkutan ve sistemik infeksiyonlara neden olan mantar kolonilerinin makroskopik ve mikroskopik muayenelerinde de, aynen kutan infeksiyonlarda bildirildiği gibi, hareket edilir.

02.01. Koloni Makromorfolojisi

Hastalık olgularından izole edilen ve saf olarak üretilen mantar kolonilerinin makroskopik olarak muayeneleri, infeksiyon etkenlerine göre az-çok değişmek üzere, genellikle, aşağıdaki tarzda yapılır:

1- Üreme durumu: Kolonilerin uygun ortamlarda gelişme, olgunlaşma durumu ve süresi saptanır ve koloninin çapı ölçülmek suretiyle üreme durumu tespit edilir. Kolonilerin üreme durumu, besi yerinin bileşimi, miktarı, inkubasyon ısısı ve süresi ile mantar türlerine göre önemli değişiklik gösterir. Ancak, dimorfik mantarların (S. schenckii, B. dermatitidis, C. immitis, H. capsulatum) 37°C'deki kolonilerinin üreme durumu ile aynı mantarların oda ısısında (25°C.) elde edilen kolonilerinin, yapı bakımından aralarında önemli farklar gösterdiğinden, üreme durumları da çok değişik olmaktadır.

2- Koloni şekli: Subkutan ve sistemik mantarların oluşturdukları koloniler genellikle oval veya yuvarlak bir görünüme sahiptirler. Kenarları, düz, çentikli, loblu, rizoid, vs. ve üzerleri de kabarık, buruşuk, ortadan kenarlara doğru kırışık veya katlı olabilmektedir.

3- Koloni topografisi: Koloniler bazı türlerde yassı veya kabarık, bir kısmında buruşuk, katlı, çizgili, vs. görünümlere sahiptirler.

4- Koloni yapısı: Subkutan ve sistemik mikozeslere neden olan mantarlardan difazik olanların (S. schenckii, B. dermatitidis, C. immitis, H. capsulatum) 37 oC'de üremiş kolonileri maya-benzeri forma sahiptirler. Bu parazitik faza ait koloniler, mukoid, nemli, yapışkan ve kabarıktırlar. Bunlarda miselyal görünüme rastlanmaz. Buna karşın, oda ısısında (20oC'de) üremiş kolonilerinde ise flamentöz yapıya tesadüf edilir ve miselyum bulunur. Bazı kolonilerde de granüler yapı formuna rastlanabilir.

5- Koloni rengi: Bu mantarlara ait kolonilerde, krema renginden siyah renge kadar değişen renk farkları görülebilir.

02.02. Koloni Mikromorfolojisi

İzole edilmiş ve uygun bir ısı ve süre ile saf olarak üretilmiş kolonilerin belli yerlerinden ve çok dikkatli bulunmak ve özel kabinet (veya inokulasyon kabineti) içinde olmak kaydı ile preparatlar hazırlanır. Bunlardan, bir kısmı, doğrudan doğruya, boyanmadan (natif muayene) ve diğer kısmı da uygun boya yöntemlerinden biri ile (Gram, Giemsa, PAS, Ziehl Neelsen, Griedley, v s.) boyandıktan sonra mikroskop altında 500 x ile ve gerektiğinde immersiyonla (1000 x) muayene edilerek, kolonilerin ince yapıları ve mantar elementleri tetkik edilir. Bu muayenede, dimorfik mantarlarda, hem parazitik forma (maya-benzeri form) ve hem de miselyal formdaki kolonilere ait mantar elementleri ve monomorfik (monofazik) mantarlara ait mantarı oluşturan yapılar incelenir. Mantar türlerine ve inkubasyon süresine göre kolonilerin mikromorfolojileri aşağıdaki gibidir:

Rhinosporidiosisde: Bu hastalığın etkeni olan, R. seeberi ’in kültürü yapılamamıştır.

Sporotrichiosisde: Oda ısısında (25°C'de) üreyen miselyal formdan yapılan preparatlarda septumlu hifalar ve bunların yanlarından çıkan tek tek veya çiçek yaprağı gibi dizilmiş konidiumlara rastlanır.

Maya benzeri kolonilerden (37°C’de üretilmiş) mikroskop altında oval veya yuvarlak, puro veya maya benzeri tomurcuklu veya tomurcuksuz hücreler görülebilir.

Aspergillosisde: Oda ısısında veya 37°C’de üremiş kolonilerde septumlu miselyum, konidiofor ve çok sayıda oval veya yuvarlak konidiumlar gözlenebilir.

Blastomycosisde: Oda ısısında üreyen kolonilerin mikromorfolojilerinde septumlu hifa, klamidospor ve hifalara kısa sapla bağlı konidiumlara rastlanır. B. dermatitidis ’in 37oC’de ki maya benzeri kolonilerinde oval veya yuvarlak, çift cidarlı ve bazıları tomurcuklu hücrelere tesadüf edilir.

Candidiasisde: Oda ısısında ve 37°C'de üreyen maya benzeri kolonilerden yapılan preparatlarda pseudomiseller, oval veya yuvarlak blastosporlar, kalın duvarlı ve iri klamidosporlar görülebilir.

Coccidioidomycosisde: Oda ısısında üreyen miselyal formdaki kolonilerde septumlu ve branşlı miselyumlar ve varil biçiminde artrosporlar bulunur. Mantarın (C. immitis) 37oC'de üremiş maya benzeri kolonilerinde ise, oval veya yuvarlak, çift cidarlı sporangium (sferula) ve endosporlara rastlanabilir.

Cryptococcosisde: C. neoformans oda ısısında ve 37°C'de maya benzeri koloniler oluşturur. Yapılan preparatlarda, oval veya yuvarlak, çift cidarlı ve etrafı kapsüllü, bazıları tomurcuklu hücreler görülür.

Histoplasmosisde: H. capsulatum oda ısısında üreyen kolonilerde septumlu hifalar, hifalardan lateral çıkan ve üzeri dikensi büyük klamidosporlar görülür.

Maya fazından yapılan preparatlarda ise küçük oval veya yuvarlak hücrelere rastlanır.

Nocardiosisde: N. asteroites ’in 37°C'de üremiş kültürlerinde branşlı flamentler ve difteroid formda mikroorganizmalar görülür.

[1] Kaynak : Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 10095 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader