Clostridium perfringens

01. Tanımı
02. Ekolojisi
03. Sınıflandırılması
04. Gelişmesi ve Canlı Kalması
05. Patojenitesi
06. Enfeksiyona Aracı Olan Gıdalar
07. Sıklığı ve Epidemiyolojisi
08. Kontrolü
09. Sayılması
10. Kullanılan Besiyerleri
    10.01. Differantial Reinforced Clostridial Medium
    10.02. TSC Agar Base
    10.03. Lactose Sulfite (LS) Medium

01. Tanımı

Cl. perfringens anaerobik, gram pozitif, spor oluşturan çubuk şeklinde bir bakteridir. Mikroskop altında genellikle tek ve ikili olarak görünürler nadiren kısa zincir oluştururlar. Sporları subterminal veya terminal pozisyonda bulunur. Bu bakteri hareketsiz olup, kapsül oluşturur ve jelatini parçalar. Bir çok karbohidratı fermente etme yeteneğine sahiptir. Litmuslu sütte asit oluşur, pıhtı yüksek oranda gaz oluşması ile dağılır ve gazlı fermentasyon (stormy fermentation) izlenir. Cl. perfringens sülfiti indirgeyen tek Clostridium türüdür. Buna bağlı olarak gıda sanayiinde “sülfit indirgeyen Clostridium” olarak kastedilen Cl. perfringens ‘tir. Nitratı indirger ve sütte gazlı fermentasyona neden olur. Hareketsiz olup TSC Agarda siyah koloniler oluşturur.

Cl. perfringens 'in oluşturduğu hastalığa perfringens gıda zehirlenmesi, zehirlenme, gıda kaynaklı hastalık, enfeksiyon ve enfeksiyon tipi gıda zehirlenmesi adları verilmiştir. Bütün bu farklı tariflerin nedeni toksin salgılanmasının S. aureus ve Cl. botulinum 'dan değişik olmasından ötürüdür. Hastalığa ait gerçek rakamların bulunmasının nedeni, arazların hafif olması ve hastalığın doktor müdahalesine gerek kalmadan kısa sürede geçmesidir. Zehirlenmelere genellikle çok sayıda kişiye hizmet veren kuruluşlarda rastlanır. Genellikle pişirilerek tüketilen gıdalarda yetersiz pişirme, yetersiz soğutma ve tekrar hafifçe ısıtma sonunda bakteri sayısı hızla artar ve hastalığa neden olur. Okullar, hastaneler, bakım evleri, hapishaneler gibi çok sayıda kişiye yemek veren ve servisten bir kaç saat önce pişirilen yemeklerde potansiyel tehlike fazladır. Genel olarak yaşlı ve düşkün kişiler Cl. perfringens zehirlenmelerine daha fazla duyarlıdırlar.

Cl. perfringens ile daha fazla genel bilgi için !!! burayı tıklayın.

02. Ekolojisi

Doğada insanların, evcil hayvanların ve yabani hayvanların bağırsaklarında bulunur. Sporları toprakta ve sedimentlerde canlılığını sürdürür ve bu bakteriye rastlanması fekal kontaminasyonun göstergesidir. Bacillus 'larda olduğu gibi hafif bir ısıtma ile sporların çimlenmesi teşvik edilir.

Cl. perfringens doğada çok yaygındır. Toprak, toz, hava, su, lağım, insan ve hayvan dışkısı ve birçok gıda maddesinin üzerinde bulunur. Hijyenik koşullara dikkat etmeyen ve genellikle yemeklerini büyük topluluklar halinde yiyen kişilerin bağırsaklarında Cl. perfringens daha çok bulunur.

03. Sınıflandırılması

Tespit edilen dört ana tip ekzotoksin mevcuttur. Bunlara alfa (a ), beta (b ), epsilon (g ) ve iota (s ) adları verilmiştir. Bunların oluşturulma durumuna bağlı olarak Cl. perfringens suşları 5' e ayrılmış ve A, B, C, D, E adları verilmiştir.

Cl. perfringens Tipleri Oluşturulan Ana Toksinler

A Alfa

B Alfa, Beta, Epsilon

C Alfa, Beta

D Alfa, Epsilon

E Alfa, İota

Gıda zehirlenmelerine neden olan temel tip A' dır. Bazı hallerde C tipinin de zehirlenmelere neden olduğu belirtilmektedir. Bütün A tipleri toksin oluşturmadığı gibi gıda zehirlenmesine neden olan gıdalardan izole edilenler de bu özelliklerini laboratuvarda besiyerine transfer edilince yitirmektedir.

04. Gelişmesi ve Canlı Kalması

Cl. perfringens gelişebilmek için 13-14 amino asidine ve 5-6 vitamine gereksinme gösterir. Bu istekleri zehirlenmelerin genellikle proteinli gıdalarda görülmesini bir ölçüde açıklar.

Cl. perfringens anaerobik olmakla beraber, aerotolerant özellik de gösterir. Bu nedenle gelişmesi için mutlak anaerobik koşullar gerekmez. Et ürünlerinin redoks potansiyeli bu organizmanın gelişmesi için uygundur. 5,5 ile 8,0 pH arasında iyi gelişir. pH 5,0 altında veya pH 9,0 üzerinde gelişemez. Enterotoksin oluşumu için en uygun pH 6,5 - 7,3 olarak bildirilmiştir.

15 oC ile 50 oC arasında gelişebilir, optimum gelişme sıcaklığı 37 oC ile 47 oC arasındadır. Bazı kaynaklar optimum gelişme sıcaklığını 43 – 47 oC olarak vermektedir. Sporulasyon ve toksin oluşumu için en uygun sıcaklık 37 oC' dır. 0,995' in altındaki su aktivitelerinde gelişme hızı azalır. Gelişme için minimum As çözünen maddeye, sıcaklık derecesine, pH' ya ve diğer faktörlere bağlıdır. Yemek (tipik olarak et) pişirildiği zaman oksijen uzaklaşır ve ortam anaerob hale geçer. Pişirme işlemi sporlanmayı da teşvik eder. Soğutma sırasında sporlar germine olur ve hızla çoğalır. Optimum gelişme koşullarında generasyon süresi 12 dakikaya kadar düşer. Bu nedenle 106 sayıda bakteri vücuda girdiğinde bunlar ince bağırsağa ulaşıncaya kadar sayılarını zehirlenmeye neden olacak düzeye çıkartırlar.

Sıcaklık derecesindeki ani düşmelerde hücreler üzerinde öldürücü etkiye sahiptir. Gelişme dönemindeki hücrelerde çevre sıcaklığı 37 oC' dan 4 oC' a düştüğünde % 96'lık bir ölüm oranı saptanabilir. 4 oC' da 90 dakika tutma sırasında ilave bir azalma daha olarak toplam indirgeme 3 logaritma birimine çıkabilir. Etleri olgunlaştırmada kullanılan sodyum nitrit ve nitrat konsantrasyonlarının çok üstündeki konsantrasyonlarda dahi gelişebilirler.

05. Patojenitesi

Oluşturduğu hastalık perfringens gıda zehirlenmesi olarak tanımlanır ve yaygın şekliyle karın krampları ve ishal ile görülür. Zayıf bünyeli kişilerde sıklıkla halsizlik de olur. Ateş ve kusma yoktur. Gıda zehirlenmesine neden olan toksini üretebilen çok sayıda Cl. perfringens içeren gıdanın tüketiminden 8-22 saat sonra hastalık başlar ve genellikle 24 saat içinde kendiliğinden biter. Rehidrasyon yaşlılarda ve zayıf bünyelilerde gerekebilir. Bazı hastalarda hastalık daha sert geçer ve 1-2 hafta kadar sürer. Dehidrasyon ve diğer komplikasyonlara bağlı olarak bir kaç ölüm olayı bildirilmiştir. Hastalığın ortaya çıkması için 108 sayıda canlı hücrenin bağırsağa ulaşması ve toksin oluşturması gerekir. 106 sayıda bakterinin gıda ile alınması halinde sindirim sistemine ulaşıncaya kadar bu sayı 108 'e ulaşmaktadır.

Hastalığın etiyolojik ajanı Clostridium perfringens enterotoksini olarak adlandırılmıştır. S. aureus ve Cl. botulinum toksinlerinin aksine Cl. perfringens enterotoksinine normal olarak gıdalarda rastlanmaz. Bunun yerine toksin bağırsak sisteminde Cl. perfringens 'in gelişmesi ve sporulasyonu ile oluşur. Laboratuvar koşullarında sporulasyonu teşvik eden ortamlarda bakterinin toksin oluşturulması mümkün olmuştur. Enterotoksin proteininin spor kılıfında yapısal bir kısım olduğu ve bazı türlerce aşırı olarak oluşturulduğu ileri sürülmektedir.

Sporulasyon ile toksin oluşumu arasında direk bir korelasyon mevcuttur. Sporulasyonun engellendiği gelişme besiyerinde enterotoksin oluşmamakta, sporulasyon besiyeri kullanıldığında toksin sentezlenmektedir. Enterotoksin ancak spor yapan hücrelerin lize olması ile ortama yayılmaktadır. Spor kılıfının (coat) oluşumu sporulasyonun ilk basamaklarındandır, nitekim enterotoksin de spor oluşumunun başlangıcından 4 saat sonra saptanmakta ve 10-11. saatlere kadar birikmeye devam etmektedir. Lizis olayı ile enterotoksin ve olgun sporlar ortama yayılmaktadır. Bununla beraber yapılan son çalışmalar spor oluşturmayan kültürlerde de toksin saptanmasına bağlı olarak toksin oluşumu ile sporlanma arasındaki ilişkiyi doğrulamamakta, toksin oluşumu ve sporlanmanın benzer çevre koşullarında tesadüfen berberce olduğu tahmin edilmektedir.

Saflaştırılan toksin protein olup nükleik asit, yağ asidi, fosfotid ve indirgen şekerleri içermez. Hidroliz ile 18 amino asit elde edilmiştir. En önemlileri aspartik asit, serin, leucin ve glutamik asittir. Molekül ağırlığı 33.000-40.000 dalton arasındadır. İzoelektrik noktası pH 4,3' tedir. Bu enterotoksin ısıya dayanıksız olup 60 oC de 4 dakikada aktivitesinin % 90' ını kaybetmektedir. Protein yapısında olmasından ötürü antijeniktir, ancak şimdiye değin oluşturan organizmanın suşuna bağlı olmayarak sadece bir antijenik entorotoksin tipi saptanmıştır.

Hastalık bir takım olayların bir birini takip etmesiyle oluşur. Gıda organizma ile kontamine olur. Pişirme esnasında vejetatif hücreler ve ısıya hassas sporlar imha olur. Fakat dayanıklı sporlar canlı kalırlar. Pişirme esnasındaki ısıtma canlı kalabilen sporları çimlenme için aktive eder. Eğer gıda gelişme için uygun bir sıcaklıkta tutulursa (10-50 oC) vejetatif hücreler çoğalırlar. Pişmiş tavuk etinde sporların 37 oC' da çimlenmesi için gerekli süre 10-12 dakika olarak saptanmıştır.

Hastalığa neden olacak Cl. perfringens adedi saptanmamış olmakla beraber gıdada 106-108 hücre olması tehlike işaretidir. Organizmalar önce midenin düşük pH'sından geçip bağırsaklara ulaşmak zorundadır. Gelişmeye hazırlanma fazının başlangıcında organizmalar en dayanıksız durumdadır. Dayanıklılık gelişme fazının sonunda maksimuma ulaşır. Tüketilen gıdada proteinlerin bulunması organizmayı mide asitlerine karşı korur. Mide asidinin tüketilen proteinlerle birleşmesi pH' da genel bir yükselmeye neden olur. Proteinlerin mide asidi üzerindeki bu etkisi bakterilerin korunmasını sağladığından proteinli gıdaların bu hastalığa daha fazla neden olması bundan ileri gelebilir.

Canlı kalan hücreler ince bağırsağa ulaşınca gelişme ve sporulasyon için uygun bir ortam bulurlar. Spor yapan hücreler enterotoksin oluşturur ve hücre lizisi sonunda toksin ortama yayılır. Organizma bazı gıdalarda da spor oluşturabilir, fakat gıda toksik bir hale gelene kadar, tüketilemeyecek bir durum alır.

Hastalığın ortaya çıkması için gerekli inkübasyon süresi 9-15 saat arasındadır. Organizmanın sporulasyonu için 7-12 saat gereklidir. Enterotoksinin gıdada daha önce oluşması, çok yüksek sayıda hücrenin gıda ile birlikte alınması, gıdayı tüketen kişinin hassasiyeti inkübasyon süresinin kısalmasına neden olur.

Bulaşık gıdayı tüketen herkes hastalanmayabilir. Mide asitliği yüksek olan bazı kişiler hastalanmadan kurtulabilirler. Daha önce zehirlenmiş olmanın hiçbir koruyucu etkisi yoktur.

En önemli iki belirti isal ve karın kramplarıdır. Bazı hallerde baş dönmesi ve baş ağrısı görülebilir. Ateş, kusma, sersemlik ve kanlı dışkı görülebilir. Gençlerde hastalık hafif geçer, yaşlı ve hasta kişilerde daha şiddetli cereyan edebilir. Başka hastalıklarla komplikasyon halinde nadiren ölüm görülebilir. Hastalık kısa sürer (12-24 saat). İyileşme tam ve herhangi bir belirti bırakmadan olur. Hasta halsiz kalırsa da kısa zamanda düzelir. Belirtilerin hafif ve kısa süreli olmasından ötürü bir tedavi uygulanmaz.

Toksin kapiler geçirgenliği arttırarak bağırsaklarda aşırı sıvı hareketine neden olur ve isal görülür. Peristaltik bağırsak hareketler artar. Bağırsak mukozasında Cl. perfringens 'in yayılıp enfeksiyon yaptığı görülmemiştir, bu nedenle etkinin sadece toksinden ileri geldiği kabul edilmiştir.

Toksin, villi tip' lerde epitel hücrelere zarar verir. Bu zarar glikoz absorbsiyonunu inhibe eder ve buna bağlı olarak Na+, Cl- ve suyun dışarı akımına neden olur. Bu durum ise lümende aşırı sıvı hareketi ve diyareye yol açar.

Daha ciddi fakat daha nadir olan bir hastalık ise Cl. perfringens 'in C tipleri tarafından oluşturulan necrotican (çürütücü) hastalığıdır. Son zamanlarda A tipinin de bu hastalığa yol açtığı saptanmıştır. "Pig-bel" ve "necrotic perfringens" olarak da bilinen bu hastalık sıklıkla öldürücüdür. Çok sayıda bakterinin vücuda alınması ile başlar ve bağırsak duvarına yapışarak b toksin oluşturur, bağırsakta enfeksiyon ve septisemiye yol açan ve tedavi edilmez ise bağırsak nekrozu (çürüme) kangrene kadar gider ve sonunda ölüm görülür. ABD' de çok nadir görülen bu hastalık ilk kez 1949 yılında Almanya' da görülmüştür. Papua Yeni Gine' de çok yaygın iken aşılama ile kayda değer ölçüde azaltılmıştır.

06. Enfeksiyona Aracı Olan Gıdalar

Bu zehirlenmeye genellikle proteinli gıdalar yol açar. Izgara, kaynatılmış veya hafif kızartılmış et veya tavuk etleri, et suyu, sosisler, çorbalar, etli börekler ve salatalar en önemli gıdalardır. Zehirlenmeye neden olan gıdalar öncelikle, bir iki gün önce pişirilip buzdolabında tutulmuş ve yeniden ısıtılarak tüketilenlerdir. Etler büyük parça halinde pişirildiğinde, ısının transferi ve piştikten sonraki soğuma yavaş olduğundan, ısıtma ile ortamdan oksijenin uzaklaşması ile oluşan anaerobik koşullar ortamı Clostridium gelişmesine ideal bir hale getirir. Türkiye ‘de sucuk Cl. perfringens açısından oldukça riskli bir gıda olarak gösterilmektedir.

07. Sıklığı ve Epidemiyolojisi

Cl. perfringens 'in gastrointestinal hastalıklara yol açtığı 1890' lı yıllardan beri bilinmektedir. Dünya üzerinde en yaygın gıda zehirlenmesi etmenleri arasındadır. 1980 'li yıllarda gıda zehirlenmeleri arasında ABD' de 3., İngiltere' de 2 sırada yer almıştır. ABD' de Cl. perfringens zehirlenmeleri en sıklıkla kayda geçen gıda zehirlenmeleri arasındadır. 1981 yılında ABD' de 28 salgında 1162 vaka bildirilmiştir. Yine ABD' de yılda ortalama 10-20 salgın ve her salgında onlarca hatta yüzlerce vaka bildirilir. Bununla beraber pek çok salgın ve/veya bireysel hastalanmanın, dışkıda toksin analizinin yapılma zorunluğu nedeni ile kayıtlara geçirilmediği bilinmekte ve buna bağlı olarak her yıl ABD' de 10.000 Cl. perfringens zehirlenmesi olduğu tahmin edilmektedir. Cl. perfringens 1 en sık rastlanan serotiptir.

08. Kontrolü

Cl. perfringens 'in doğada çok yaygın olması nedeni ile gıdalara bulaşmasının engellenmesi, zehirlenmeleri kontrolü için yeterli değildir. Buna rağmen sanitasyonun tam anlamıyla uygulanmasının ihmal edilmemesi gereklidir. Eğer bu konuda dikkatli davranılırsa kontaminasyon oranı asgariye indirilebilir. Kontaminasyon engellenirse, tehlike düzeyi olan 106-108 adet/g' a ulaşmak uzun sürecektir. Gıdada birkaç Cl. perfringens bulunması zehirlenmeye neden olmaz. Bu nedenle sporların germinasyonu ve vejetatif hücrelerin bölünmesi engellenirse tehlike kontrol altına alınabilir. En basit yöntem gıdayı pişirmek ve uzun süre bekletmeden tüketime sunmaktır. Bu mümkün değil ise gıdayı küçük parçalara ayırarak soğukta saklamak gelişmeyi engeller. Gelişme için minimum sıcaklık 15 oC' dır. Çok dolu olmadığı taktirde her buzdolabında bu kolaylıkla sağlanır. Sıcaklık 0 oC' a yaklaştıkça populasyon azalmaya başlar, vejetatif hücreler bu derecelerde stabil değildir. Sporlar bile kısmen hasar görürler.

Cl. perfringens 'in vejetatif hücreleri pişirme ile yok edilir. Fakat ısıya dayanıklı sporlar canlı kalabilir. Sporların öldürücü düzeyin altında ısıya tabi tutulması germinasyonu teşvik eder. Sporların ısıya dayanıklılığı suştan suşa farklılık gösterir. Eğer ısıya dayanıklı sporlar varsa, bunların yok edilmesi için gıdanın ısıtılması uzun süreceğinden arzu edilmeyen organoleptik bozulmalar oluşur.

Pişirildikten sonra bekletilen gıdalar, buzdolabında dahi saklanmış olsalar, tüketilmeden önce mutlaka ısıtılmalıdır. Salçalı yemekler 10-11 dakika kaynatılmalı tavuk etleri mutlaka 80 oC' a kadar ısıtılmalıdır.

09. Sayılması

Sülfit indirgeyen anaerobların sayımı EMS yöntemi ile yapılır. Bu amaçla en yaygın olarak Differantial Reinforced Clostridial Broth (DRCM ; Merck 1.11699) besiyeri kullanılır. Standart yöntemle tüplere ekimden sonra tüplerin üstü anaerob ortam sağlamak üzere yaklaşık 2 cm (4 ml) sıvı parafin (Paraffine Viscous ; Merck 1.07160) ilave edilip vejetatif hücrelerin öldürülmesi ve sporların germinasyonunu sağlamak için su banyosunda 75 oC' da 30 dakika bekletilir. İnkübasyon 30 oC' da 7 güne kadar devam eder. Pozitif reaksiyon genellikle 3-4 gün içinde alınır. Siyah renk oluşumu sülfit indirgeyen Clostridium’ ların varlığını gösterir.

Sülfit indirgeyen Clostridium 'ların sayılması katı besiyerinde de yapılabilir Bu amaçla yumurta sarısı ilave edilmiş Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) Agar (Merck 1.11972) besiyeri kullanılabilir. Ekimi yapılan petri kutularının üzerine besiyeri katılaştıktan sonra standart (yumurta sarısı emülsiyonu içermeyen) TSC Agar besiyerinden ikinci katman olarak yaklaşık 10 ml dökülür. 37 oC' da 24 saat anaerobik inkübasyon sonunda siyah renkli koloniler sülfit indirgeyen Clostridium 'lar olarak sayılırken Cl. perfringens lesitinaz aktivitesine bağlı olarak etrafında opak bir zon olan 2-4 mm çaplı siyah koloniler oluşturur.

Cl. perfringens ile daha fazla analiz bilgisi için !!! burayı tıklayın.

Şüpheli bir gıdada Cl. perfringens aranmasında dikkat edilecek en önemli hususlardan birisi Cl. perfringens 'in dondurma ya da uzun süreli soğukta depolama işlemlerinde canlılığını yitireceğidir. Dolayısıyla Cl. perfringens aranacak gıda analizden önce donduruldu veya uzun süreli soğukta bekletildi ise önceden zehirlenmeye neden olan bu gıdada Cl. perfringens saptanamayabilir.

Cl. perfringens aranacak gıdalarda şüpheli örnekten tam bir porsiyon alınması, bu mümkün değilse gıdanın farklı yerlerinden toplam 25 g örnek alınması gerekir. Cl. perfringens 1 porsiyon gıdanın sadece küçük bir bölgesinde lokalize olabilir. Bu nedenle alınacak örneğin tüm porsiyonu temsil etmesi önemlidir.

Gıda örneği en geç 8 saat içinde analize alınmalı ve bu süre içinde 10 oC' da tutulmalıdır. Zorunlu nedenlerle bu süre geçilecek ise analiz örneği tamponlanmış steril gliserin-tuz çözeltisi içinde -60 oC' da dondurulmalıdır. Bu amaçla 25 g gıda için 25 ml çözelti yeterlidir. Gıda ile tamponlanmış steril gliserin tuz çözeltisi iyice karıştırıldıktan sonra kuru buz içinde hızla dondurulur. Dondurulmuş bu örnek laboratuvara taşıma, bekletme gibi aşamalarda aynı sıcaklıkta korunmalıdır.

Cl. perfringens aranmasında dikkat edilecek ikinci önemli husus homojenizasyondur. Bu işlemde blender kullanılacak ise düşük devir ve kısa süre kullanılmalıdır. Her ne kadar Cl. perfringens aerotolerant bir anaerob bakteri ise de blenderdeki homojenizasyon sırasında oluşacak anafora bağlı olarak hücreler aşırı miktarda oksijen ile temas eder ve oksijen Cl. perfringens 'e zarar verir.

Cl. perfringens aranmasında en yaygın kullanılan besiyeri TSC Agar besiyeridir. Bazal besiyeri hazırlanıp sterilize edildikten sonra 50 oC' a soğutulur ve D-Cycloserine' in filitre ile sterilize edilmiş %5' lik çözeltisinden litreye 10 ml ilave edilir, karıştırılır ve petri kutularına dökülür. Bu şekilde hazırlanmış besiyerleri 4 gün içinde kullanılmalıdır.

Amaca (beklenen sayıya) göre dökme ya da yayma kültürel sayım yöntemi uygulanabilir. Her iki yöntemde de ekim yapıldıktan 10-15 dakika sonra petri kutusuna aynı besiyerinden ikinci katman olarak yaklaşık 10 ml daha dökülür ve 37 oC' da 24 saat süre ile ve anaerobik koşullarda inkübasyon yapılır.

TSC agar besiyerinde oluşan siyah renkli koloniler muhtemel Cl. perfringens olarak değerlendirilir. Petri kutularından izole edilecek kolonilerin Cl. perfringens olup olmadıkları doğrulanır ve standart yöntemlerle örnekteki Cl. perfringens sayısı hesaplanır. Cl. perfringens Lactose Sulfide (LS) besiyerinde gaz ve siyahlaşma ile doğrulanır.

Cl. perfringens 'in sayılmasında son yıllarda geliştirilen bir başka teknik TSC Agar besiyerine MUP (4-Methylumbelliferyl phosphate) katılmasıdır. MUP, alkali ve asit fosfataz için kullanılan fluorejenik bir substrattır. Asit fosfataz Cl. perfringens için yüksek düzeyde spesifiktir. Asit fosfataz MUP' u 366 nm uzun dalga boylu ultraviyole ışınında floresan veren 4-methylumbelliferone' a parçalar.

Cl. perfringens 'in doğrulanması LS Medium besiyeri kullanılarak yapılır. Doğrulanacak koloni Fluid Thioglycollate Medium (Merck 1.08191) besiyerinde anaerobik atmosferde olacak şekilde 37 oC' da 24 saat inkübe edilir. Bu süre sonunda LS besiyerine steril pipet ile 5 damla olacak şekilde aşılanıp su banyosunda 46 oC' da 24 saat inkübe edilir. Durham tüpünde gaz oluşumu ve siyah presipitat oluşumu Cl. perfringens için pozitif sonuçlardır. Şüpheli durumlarda LS besiyerinden bir başka LS besiyerine yine 5 damla aktarılarak aynı koşullarda test tekrarlanır.

10. Kullanılan Besiyerleri

10.01. Differantial Reinforced Clostridial Medium (DRCM ; Merck 1.11699)

Dehidre besiyeri 27,5 g/l olacak şekilde distile su içinde ısıtılarak çözülür ve tüplere 10' ar ml dağıtılıp otoklavda 121 oC' da sterilize edilir. Bu besiyeri Reinforced Clostridial Medium' un geliştirilmiş şeklidir. Redoks indikatörü olan resazurin anaerobik atmosferin sağlandığını göstermek için kullanılır. Clostridium 'lar sülfiti sülfüre indirgerler ve demir sülfür oluşumuna bağlı olarak besiyeri siyahlaşır. Aynı indirgemeyi sağlayabilen diğer bakterilerden sporsuz olanlar ekimden sonraki pastörizasyon ile, sporlu aeroblar ise anaerob inkübasyon ile baskılanır. Hazırlanmış besiyeri berrak ve açık kahve-kırmızımsı renktedir. Hazırlanmış besiyeri 2 hafta depolanabilir. 500 g olan 1 kutu dehidre besiyeri ile 1818 tüp hazırlanabilir. Bu besiyeri hakkında daha fazla bilgi için !!! burayı tıklayın.

10.02. TSC Agar Base (Merck 1.1.11972)

Dehidre besiyeri 42 g/l olacak şekilde distile su içinde ısıtılarak eritilir ve manyetik taş ile birlikte otoklavda 121 oC' da sterilize edilir. Sülfit indirgeyen Clostridium 'ların sayımı için yumurta sarısı ilavesi gerektiğinde 80 ml/l konsantrasyonda olacak şekilde steril yumurta sarısı emülsiyonu (Merck 1.03784) 50 oC' a kadar soğutulup su banyosunda tutulan bazal besiyerine ilave edilip manyetik karıştırıcıda karıştırılır ve steril petri kutularına 12,5' er ml dökülür. Cl. perfringens sayımı için bazal besiyeri 50 oC' a soğutulduktan sonra filitre ile sterilize edilmiş %5 konsantrasyondaki D-Cycloserine (Merck 1.08097) çözeltisinden 10 ml/l olacak şekilde ilave edilip manyetik karıştırıcıda karıştırılır ve yine 12,5 ml/petri olacak şekilde steril petri kutularına 12,5' er ml dökülür. Hazırlanmış besiyeri berrak ve açık kahve renklidir. Sikloserin ilave edilmiş besiyeri 4 gün içinde kullanılmalıdır. Yeni yönteme göre Cl. perfringens 'in MUP ilave edilmiş TSC Agar besiyerinde sayılması için 1 şişe selektif katkı (Fluorocult TSC Agar Supplement ; Merck 1.04032) sterilize edilip 50 oC' a soğutulmuş 500 ml TSC Agar besiyerine ilave edilip karıştırılır ve standart şekilde (dökme kültür ya da yayma kültür) kullanılır. İnkübasyon sonunda 366 nm uzun dalga boylu UV el lambası ile (Merck 1.13203) floresan ışınım veren koloniler Cl. perfringens olarak sayılır. Bu yöntem uygulandığında inkübasyon anaerobik koşullarda ve 44 oC' da 18-22 saat süre ile yapılır. Anaerobik inkübasyon için !!! burayı tıklayın.Selektif katkı sikloserin de içerir ve bu nedenle ayrıca sikloserin ilavesine gerek yoktur. Selektif katkı 5 ml steril distile su içinde çözülebileceği gibi bileşimi 9,0 g/l sodyum klorür (Merck 1.06400), 1,43 g/l disodyum hidrojen fosfat (Merck 1.06586) ve 0,267 g/l potasyum dihidrojen fosfat (Merck 1.04871) olan ve otoklavda 121 oC' da 15 dakika sterilize edilmiş tamponlanmış fosfat tuz çözeltisinden yine 5 ml kullanılarak da çözülebilir. Selektif katkı ilave edilmiş besiyeri 4 gün içinde kullanılmalıdır. TSC Agar bileşimindeki besin maddeleri Cl. perfringens gelişimini sağlarken hidrojen sülfür oluşumu kolonilerin siyahlaşması ile belirlenir. Sikloserin refakatçi flora gelişimini baskılar. 500 g olan 1 kutu TSC Agar dehidre besiyeri ile ve 12,5 ml/petri olacak şekilde ; TSC Agar + yumurta sarısı emülsiyonu için 961 petri, TSC + D-Cycloserine için 952 petri ve TSC Agar + MUP için 920 petri kutusu hazırlanabilir. MUP ile ilgili daha fazla bilgi için !!! burayı tıklayın.Bu besiyeri hakkında daha fazla bilgi için !!! burayı tıklayın.

10.03. Lactose Sulfite (LS) Medium

Bazal besiyeri bileşimi 1 litrede Caseine Peptone 5,0 g (Merck 1.07213), Yeast Extract 2,5 g (Merck 1.03753), Sodium Chloride 2,5 g (Merck 1.06404), Lactose 10,0 g (Merck 1.07657), L-Cystein hydrochloride monohydrate 0,3 g (Merck 1.02839) şeklindedir. Bileşenler gerekirse ısıtılarak distile su içinde çözülüp içinde durham tüpü bulunan tüplere 8' er ml olarak dağıtılıp otoklavda 121 oC' da sterilize edilir. Bazal besiyeri buzdolabında 1 ay depolanabilir. Besiyeri kullanılacağı zaman tüplere filitre ile sterilize edilmiş %1,2 konsantrasyonda susuz disodyum disülfit (Merck 1.06357) çözeltisinden 0,5 ml ve yine filitre ile sterilize edilmiş amonyum demir (III) sitrat (Merck 1.03762) çözeltisinden 0,5 ml ilave edilir. Eğer bazal besiyeri hazırlandığı gün kullanılmayıp depolanacak ise kullanılacağı zaman kaynar su banyosunda 15 dakika tutulur ve hızla oda sıcaklığına soğutulur. Susuz disodyum disülfit ve amonyum demir (III) sitrat çözeltiler bazal besiyerine ilave edilecekleri gün hazırlanmalıdır. Katkıları ilave edilmiş besiyeri aynı gün kullanılmalıdır.


Bu sayfa 22048 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader