Patojenik Mantarların Immunolojisi

Patojenik  Mantarların  İmmunolojisi   

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji1

01. Giriş
02. Serolojik  ve  Alerjik Testler
 
02.01. Kutan Mikozesler 
02.02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler  
03. Kültürlerin Muhafazası
 
04. Mikofajik  Böceklerin Kontrolü

01. Giriş

Mantarlardan ileri gelen infeksiyonlarda vücut, mantar elementlerine karşı immunolojik bir yanıt verir. Bu cevap, bakteriyel antijenlere oranla zayıf olmakla beraber, kendini humoral ve sellüler tarzda belli eder. Mantar elementlerinin vücuda girmesi ile lenfoid sisteme ait retikuloendotelyal sistem (RES) aktivite kazanır veya uyarılır. Hücresel veya sıvısal yanıtın derecesi ve bunlardan birine ait öncelik sırası, infeksiyonun türüne göre değişir. Bazı hastalıklarda ilk önce deri duyarlılığı oluşur ve bunu deri testleri ile ortaya koymak mümkün olabilir. Diğer bazı hastalıklarda da humoral yanıt önce belirir.

Mantar hastalıklarında oluşan antikorları saptamak için,mikrobiyolojide kullanılan yöntemler, aynen burada da uygulanır. Bu reaksiyonlar, genellikle, sistemik mantar infeksiyonlarında daha fazla kullanma alanına sahiptir. Aglütinasyon reaksiyonu mantar infeksiyonlarında çok az kullanılır. Komplement fikzasyon testi ise, yararlanılan ve güvenilen bir serolojik yöntemdir. Bu reaksiyondan, özellikle, sistemik infeksiyonların teşhisinde faydalanılır. Komplementi fikze eden antikorlar presipitinlerden sonra ortaya çıkarlar ve IgG karakterinde olup kanda uzun süre kalabilirler. İnfeksiyonun şiddeti artıkça, bu teste ait titre de yüksek bir düzeye ulaşır ve hastalık süresince teşhise yardımcı olur. Titrenin yüksek olması prognozun iyi olmadığına bir kanıt sayılabilir (Örn. İnsanlarda, Coccidioidomycosisde). Presipitasyon reaksiyonu, bu yöntem genellikle, IgM karakterinde olan antikorları (presipitinleri) saptamada işe yarar. Bir çok mantar hastalıklarında, presipitinler erken oluşurlar ve 3 hafta kadar yüksek titrede kalırlar. İmmunfluoresans testi, özellikle, H. capsulatum, Candida türleri, C. neoformans, S.  schenckii, B. dermatitidis gibi sistemik infeksiyonlara neden olan mantarların saptanmasında kullanılan önemli ve yararlı bir yöntemdir. İmmundiffusyon tekniği de mantarlar arasındaki ortak antijenik komponentlerin saptanmasında kullanılmaktadır. Ancak, bu durum testin spesifitesini azaltıcı role sahiptir. C. neoformans ve B. dermatitidis 'e ait komponentler genellikle zayıf olduğundan, vücuttaki immunojenik uyarımı da düşük olmakta ve oluşan antikorları saptamada güçlükler çekilmektedir. Ayrıca, teşhisin çok önemli olduğu infeksiyonun başlangıcını tespit etmekte, oluşan antikorların yetersizliği nedeniyle, olanaksızdır. Bakteriyel ve viral infeksiyonların teşhisinde çok kullanılan  ELİSA mantar hastalıklarının tanımında çok sınırlı kullanılmaktadır.

Mantarlardan etkin bir antijen hazırlamak ve bunları standardize etmek de oldukça zordur. Özellikle, patojenik dimorfik mantarların, vücuttaki parazitik formları ile in vitro formları arasında oldukça farklı morfolojik ve antijenik ayrılıklar vardır. H. capsulatum 'un h-antijeni, aktif infeksiyon hallerinde antikor oluşturmasına karşın, m-antijeni ise daha ziyade latent infeksiyonlarda antikor meydana getirmektedir. Diğer bir antijenik faktör olan, c-antijeni ise spesifik olmayan bir karakter gösterir ve bir çok mantarlarda da ortaktır. Bu mantara ait olan diğer antijenik komponentler de n.y ve x olarak identifiye edilmiştir. Histoplasma üzerinde yapılan antijenik analiz çalışmalarında 7 antijenik fraksiyonun da, özellikle, h- ve m- antijenlerinde toplandığı ortaya konulmuştur. Son yıllarda, Cryptococcosisli hastaların kanında ve serebrospinal sıvılarında antikor aramaktan ziyade, bu mantara ait antijenlerin varlığını ortaya konan yöntemlerin geliştirilmesi üzerinde durulmaktadır. H. capsulatum ve C. immitis' den ileri gelen infeksiyonlarda dokularda bulunan mantar elementlerinin antijenik komponentleri özellikle, mantar hücre duvarlarında lokalize olmuşlardır. Bileşiminde lipid, polisakkarid, protein ve kitin gibi substanslar vardır.

Blastomycosis olgularında presipitasyonla saptanan antikorlar ancak %50 oranında aktif infeksiyonu gösterdiği bildirilmektedir. Coccidioidomycosisde komplement fikzasyonla  veya immundiffusyonla ortaya konan antikorlar ise, infeksiyonun şiddetini ifade eder. Yaygın infeksiyon olgularında kanda yüksek titrede antikor bulunmasına karşın, tek veya ekstrapulmoner lezyon olguların antikor titresi daha düşüktür.

Candida türlerinde immunelektroforez yöntemi ile 5 antijenik grup ayrılmış olup, bunların esasını protein ve polisakkaridler oluşturmaktadır. S. schenckii’nin tüm hücresi kullanılarak hazırlanan antijenle yapılan aglütinasyon ve komplement fikzasyon yöntemleri, sonuçları bakımından birbirlerine paralellik gösterdiği açıklanmıştır.

Mucor, Aspergillus ve Nocardia türleri vücutta çok az bir immunolojik uyarım meydana getirirler. Dermatofitlerin indirekt teşhislerinde de serolojik yöntemler, genellikle, sınırlı kalmaktadırlar. Çünkü, bu mantarlara ait elementlerin vücuttaki humoral yanıtları, aynı antijenik komponentlerin, sellüler reaksiyonlarından daha az olmaktadır.

Mantar hastalıklarında hücresel bağışıklık (sellüler immunite) teşhis de büyük kolaylıklar sağlar. Bu türlü yanıtta, T-hücreleri önemli görev yaparlar. T-lenfositlerinin başlıca 5 görevi bulunmaktadır :1-Geciken türde kutan aşırı duyarlılık (tüberkülin, histoplasmin, coccidiodin, vs.), 2-Patojenik mantarlara (ve viruslara) karşı savunma, 3-Allograft reddi ve bununla ilişkili reaksiyonlar, 4-Tümörlerin kontrol altına alınmaları ve 5- Hücresel savunmada etkin role sahiptirler (lenfokin sentezi). T-hücreleri tarafından meydana getirilen substanslara, mediatör veya lenfokin adı verilmektedir. Eğer, T-hücrelerinin fonksiyonlarına mani olunursa mantar infeksiyonları, özellikle, Candidiasis, Aspergillosis, Cryptcoccosis, Phycomycosis, olguları fazlaca görülmektedir.

Dermatomycosis ve sistemik infeksiyonlarda, hastaların derisinde duyarlılık meydana gelir. Bu durum deri testi ile ortaya konabilmektedir. Bu amaçla, mantarlardan hazırlanan çeşitli allergenler veya antijenler (trichofitin, coccidiodin, blastomycin, histoplasmin, sporothricin, oidiomycin, vs) kullanılmaktadır. Bazı mantar infeksiyonlarında deri testlerinde kros reaksiyonlara rastlanmaktadır. Ayrıca, bazılarında da (özellikle bazı dermatofitlerde, E. floccosum, M. audouinii, T. schoenleinii, T. rubrum vs. gibi) sensitizan karakter, daha zayıf olmaktadır. Deri testini yapabilmek için, mantarlardan özel yöntemlerle hazırlanan, saflaştırılan ve standardize edilmiş allergenler, deri içine 0.1 ml. miktarında şırınga edilir. Pozitif reaksiyonlar da şırınga yerinde 1 cm. çapına kadar değişebilen büyüklükte ve halka biçiminde kızarıklık meydana gelir. Reaksiyon bazen çok çabuk (bir kaç dakika içinde) bazen de geç 24-48 saat içinde (nadiren bir haftaya kadar) oluşur. İnsanlarda klinik olarak bir infeksiyonun saptanamadığı olgularda, deri testleri pozitif çıkabilmektedirler. Bu durum, vücudun, daha önceden mantarla temasa geldiğini ve deride duyarlılığın kaldığını göstermektedir.

Mantar infeksiyonlarından bağışıklıkla korunmada bazı aşılar hazırlanmış ve denenmiştir. Ancak aşıları hazırlama tekniklerinin farklılığı yanı sıra bunların standardize edilmeleri de önemli güçlükler yaratmaktadır. Aşılar genellikle, öldürülmüş (60 oC. de 2 saat tutularak) misellerin fizyolojik su içinde ezilmesi ile hazırlanan ve homojenize edilen süspansiyonlarıdır. Maya benzeri koloni oluşturan mantarlardan veya dimorfik mantarların maya benzeri kolonilerinden de aşılar hazırlanır ve kullanılabilir. Bu aşıların sterilite kontrolleri yapıldıktan sonra, içine konservatif olarak %0.5 fenol,%0.3 trikresol veya mertiolet 1/10.000 oranında katılır. Ancak, şimdiye dek,  infeksiyondan koruyabilecek bir aşı geliştirilememiş veya pratiğe konamamıştır.

02. Serolojik  ve  Alerjik Testler

Mantar hastalıklarının teşhisinde serolojik testler, bakteriyel ve viral infeksiyonlardaki kullanma alanı kadar pek yaygın olmayıp çok sınırlıdır. Hatta çoğu zaman kullanılmamaktadır.  

02.01. Kutan Mikozesler

Dermatofitlerin teşhisinde, serolojik (aglütinasyon, komplement fikzasyon, presipitasyon, ve diğerleri) ve alerjik testler genellikle kullanılmaktadır. Dermatofitler zayıf immunojenik veya immunostimulan etkiye sahiptirler. Ancak, alerjik özelliği olduklarından deri testlerinde yararlar sağlamaktadırlar.

02.02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler

Rhinosporidiosis : İnsan ve hayvanlardaki Rhinosporidiosis infeksiyonlarında serolojik ve alerjik testlerden yararlanılamamaktadır.

Sporotrichosis: Laboratuar hayvanlarında yapılan deneysel infeksiyonlarda çok zayıf bir antikor düzeyine rastlanır. Bu antikorlar, komplement fikzasyon, aglütinasyon ve presipitasyon teknikleriyle ortaya konabilmektedir. Evcil hayvanlardaki doğal infeksiyonlardaki antikor durumu hakkında yeterli bilgiler yoktur. Presipitasyon testinin, bu infeksiyonda daha duyarlı olduğu bildirilmiştir. Ancak, diğer  bazı mantarlarda kros reaksiyon vermesi testin duyarlılığını azaltır.

İnsanlarda doğal infeksiyonlarda, yukarıda anılan antikorlar oluşur. Ancak, deride lokalize olan olgularda bu antikorlar diagnostik düzeyin altındadır veya hiç meydana gelmezler.

Serolojik testler içinde fluoresens antikor, latex aglütinasyon ve agar-jel diffusyon tekniklerinden yararlanılmaktadır. S. schenckii’nin maya formundan ısıtılarak elde edilen deri testi antijeni (sporotricin) insanlarda teşhis için kullanılmaktadır.

Aspergillosis: Bu infeksiyonun teşhisinde immunodiffusyon ve komplement fikzasyon testleri uygulanabilir.

Blastomycosis: İnsanlarda serolojik testler, Histoplasmosis ve Coccidioidomycosis de olduğu kadar pek güvenilir değildir. Komplement fikzasyon testi infeksiyonun başlangıcında negatif olmasına karşın zamanla titre yükselmesi ile test de pozitif çalışır. İyileşme olduktan sonra antikorlar kaybolur. Yüksek komplement fikzasyon titresi ve negatif deri testi prognozun iyi olmadığını gösterir. Immunodifusyon testi çok duyarlıdır. Bu test, Histoplasmosis ile de kros reaksiyon verir. Kültür filtratlarından elde edilen allergen (Blastomycin) insanlarda deri testinde kullanılır.

Köpeklerde, Blastomycosis infeksiyonlarında, komplement fikzasyon testinden yararlanılmaktadır. Ancak, test çok spesifik olmasına karşın, bu testle pozitif reaksiyon veren serumlar Histoplasmosis ve Coccidioidomycosis ile de daha düşük titrede olsa bile, kros reaksiyon vermektedirler.

Diğer serolojik testler (aglütinasyon, presipitasyon, agar gel diffusyon, vs.) daha az kullanılır. B. dermatitidis ’in sentetik ortamlarda üretilmesi sonu elde edilen filtrat (Blastomycin) deri testi için kullanılır. Bu allergen, Histoplasmin ve Coccidiodin kadar spesifik değildir.

Candidiasis: Bu hastalıkta, insanlarda, immunodifusyon, aglütinasyon, latex aglütinasyon, fluoresens antikor ve presipitasyon testleri ile etkenden elde edilen allergen (Oidiomycin) deri testlerinde kullanılabilir. Latex aglütinasyon testi, Cryptococcosis ve Tuberculosisli hasta serumlarıyla kros reaksiyon verebilir.

Coccidioidomycosis: İnsanlarda  Coccidioidomycosisin teşhisinde, komplement fikzasyon, latex aglütinasyon ve presipitasyon testlerinden yararlanıldığı gibi deri testinde de coccidiodin de kullanılabilir.

Cryptococcosis : İnsanlarda infeksiyonun teşhisinde, daha ziyade indirekt fluoresens antikor yöntemi ve daha az olarak komplement fikzasyon ve aglütinasyon tekniği kullanılır. Ayrıca, deri testi için, Coccidioidinden yararlar sağlanabilir. Ancak  bu son test, Histoplasmosis ve Blastomycosisli hastalarda da pozitif çalışır.

Histoplasmosis : Komplement fikzasyon reaksiyonu antijeni (maya ve miselyal form dan hazırlanan) ve latex aglütinasyon testi, insanlarda Histoplasmosis de kullanılabilir.

Nocardiosis : İnsanlarda da, serolojik testlerden ziyade, mikroorganizmadan elde edilen allergen (Nocardin) deri testlerinde yararlanılmaktadır.  

03. Kültürlerin Muhafazası

Kültürlerin muhafazası, mantarların makro-ve mikro morfolojik özelliklerinin korunmasında büyük yararlar sağlar. Bunun için başlıca yöntemler kısaca şöyledir:

1- Kültürlerin oda ısısında muhafazası: Bu yöntem zaman alıcı ve biraz da masraflı olmaktadır. Kültürlerin 2-3 ayda bir pasajı yapılarak devam ettirilir. Subkültürler tüplerde yapılır ve pasaj için, koloninin tipik yerlerinden seçilir. Ancak, uzun süre subkültürler pleomorfizme neden olabilir. Tüplerin ağzı parafin ile kapatılarak kurumaları önlenir. İyi bir üreme elde edildikten sonra, tüpler bir kutu veya tel sepete konarak oda ısısında ve belli özel yerlerde muhafaza edilirler.

Bazı araştırıcılar, besi yerinin her pasajda değişimini uygun görmekte ve örneğin, önce A ortamı kullanılmışsa sonra B vasatı, sonra tekrar A besi yeri ve B ortamı kullanmanın mantarları daha iyi durumda tuttuğunu bildirmektedirler.

2- Soğukta muhafaza: Üremiş kültürler 5-10° C. arasındaki özel yerlerde muhafaza edilebilirler. Bu ısıda kuruma azdır ve kültürlerin 3-4 ay aralıkla pasajı yapılabilir. Dermatofitler bu ısıya uzun süre dayanmasına karşın bazı türler (E. flocosum, M. aoudouinii, T. schoenlenii, T. violaceum) için uygun olmayabilir.

3- Dondurarak muhafaza: Dondurma, dermatofitlerin en iyi muhafaza yöntemidir. Tüplerde üretilen 10-14 günlük kültürler üzerine yağsız süt veya % 5-7 DMSO katarak -20°C. veya daha düşük ısıda muhafaza edilirler.

4- Suda muhafaza: İçinde 5-10 ml. steril fizyolojik su veya distile su bulunan tüplere kültür parçası (sporlu) konarak ağzı pamuk veya mantarla kapatılarak oda ısısında veya buzdolabında muhafaza edilebilir. Pasajlar yapılmadan önce, canlılık kontrolleri yapılır ve canlı olanlar subkültür için kullanılır. Bu yöntemin pleomorfizmi önlediği bildirilmektedir.

5- Kültürlerin mineral yağ tabakası altında muhafazası: Tüplerde üremiş kültürlerin üzerine, kaplayacak derecede, sterilize edilmiş (otoklavda 120oC'de 45 dakika) mineral yağ ilave edilir. Böyle hazırlanan kültürler oda ısısında bir kaç yıl saklanabilirler. Bazen yağ tabakası altında üremeye de rastlanabilir.

Sıvı parafin de bu amaç için kullanılabilir.

6- Liyofilizasyon: Bu yöntem de çok fazla kullanılmaktadır. Bu amaçla yağsız sütten (%10) yararlanılır. İçinde mantar üremiş tüplere 5 ml. miktarında konarak, steril bir öze ile mantar süt içinde süspansiyon yapılır. Bu süspansiyondan ampullere 1 veya 2 ml. kadar taksim edilir. Ampuller hemen -25°C' deki alkol içine daldırılarak dondurulurlar. Sonra, hemen, vakumla havaları alınır ve liyofilize edilir. Ampullerin iyi kapatılıp kapatılmadığı veya içinde hava olup olmadığı özel aletle kontrol edilir. Her türden 9-10 ampul hazırlanır. Liyofilizasyonun sonunda bir tanesi açılarak kontrol edilir. Kontrolde üreme varsa, diğerleri oda ısısında muhafaza edilebilirler.

7- Steril toprakta muhafaza: İçinde steril toprak bulunan tüp veya şişelere mantar süspansiyonları katılarak buz dolabında muhafaza edilebilirler. Bu teknik yaygın kullanılmamaktadır.

8- Sıvı nitrojende muhafaza: Gliserin (%10) için de suspansiyonları yapılan mantarlar 190oC' de muhafaza edilebilirler.

04. Mikofajik  Böceklerin Kontrolü

Bu böcekler laboratuarlara toprak veya infekte marazi maddelerle getirilirler. Bu böcekler, genellikle, mantar yiyen cinse, Tarsonemusa aittirler. Boyları 1 mm. kadardır. Tüplerin pamuğunu delerek içeri girer ve kültürleri yerler. Bunların yumurtaları da pasajlarla nakledildiği için, subkültürler devamlı kontamine çıkarlar. Önerilen bazı akarisidler (paradiklor benzen, dikloro etan, vs.) hem insan ve hem de mantar için zararlıdırlar. Bu amaçla aşağıdaki önlemler alınır :  

1- Sabouraud dekstroz agara ,%0.01 oranında Lindan tozu karıştırılarak besi yeri hazırlanır. Sonra, mantarlar ekilir. Lindan böcekleri öldürür. Veya,  

2- Böcekli kültürler timol buharına tutulur. Bunun için, dip tarafından timol kristalleri bulunan bir kaba kontamine kültürler konur ve kabın ağzı iyice kapatılır. Timol buharı hem ergin böcekleri ve hem de yumurtalarını öldürür. Timol buharları insan için (temas veya buhar) toksik değildir.

 3- Tüplerin ağzına konan pamuk tıkacın dışta kalan kısmına alkol (%96) 500 ml.+ Su 450 ml. + HgCL2 10 g+ gliserin 50 ml. den ibaret karışımdan bir kaç damla konur. Bu solüsyon böcekleri öldürür. Bu yöntem de çok kullanılmaktadır. 

[1] Kaynak : Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 7907 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader