Virusların Üretilmesi

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji1

01. Genel Bilgiler  
02. Embriyolu Yumurtalar
 
03. Hücre Kültürleri
 
04. Deneme Hayvanları

01. Genel Bilgiler

Viruslar, yapılarının basit olması nedeni ile gerek izolasyonları ve gerekse üretilmeleri için canlı sistemlerden (embriyolu yumurtalar, hücre kültürleri, deneme hayvanları) yararlanılır. Her virusun kolayca üreyebileceği bir konakçısı veya hücresi bulunmakta ve bunlardan yararlanılmaktadır. Ancak, bazı virusların konakcı ve hücre türü spektrumu oldukça değişiktir ve geniştir.

Virusların üretilmesinde, virolojik çalışmalarda, aşı üretiminde, ve diğer araştırmalarda kullanılan canlı sitemler ve özellikleri aşağıda kısaca belirtilmiştir.  

02. Embriyolu Yumurtalar

Kanatlı hayvan virusları (Newcastle, IB, ILT, EDS-76, Çiçek, Gumboro, vs) başta olmak üzere memeli hayvan virusları (kuduz, sığır vebası, çiçek, vs.) ve insanlarda hastalık oluşturan bazı viruslar (Kabakulak, İnfluenzae, Çiçek, Herpes simplex, Kuduz, vs.) embriyolu yumurtaların değişik yerlerinde (sarı kesesi, korioallantoik membran ve kesesi, allantoik kese) kolayca üretilebilmiştir. En fazla tavuk yumurtası olmak üzere ördek, kaz, hindi ve diğer kanatlıların yumurtalarından da yararlanılmaktadır.

Virusların ve özellikle aşıların üretiminde kullanılacak yumurtaların normal büyüklükte, beyaz kabuklu, sağlam ve temiz olması; çatlak, pis, kirli, normalden büyük veya küçük, ince kabuklu olmaması gereklidir. Ayrıca, homolog antikor (maternal antikor) içermemelidir.

Yumurtaların herhangi bir bakteri, virus ve antikor taşımaması için SPF (specific pathogen free) özellikte yetiştirilen tavuklardan temin edilmesi gereklidir. Konvansiyonel yetiştirilenlerden sağlanan yumurtalar, oldukça fazla sakıncalar yaratacağından kullanılmaması çok doğru olur. Ancak, zorunlu hallerde, infeksiyon geçirmemiş veya hastalık bulunmayan temiz, bakımlı ve sağlıklı hayvanların yumurtalarından da yararlanılabilir.

Normal yetiştirme karakterine sahip yerlerden temin edilen yumurtalara, mikroorganizmalar ya vertikal (infekte anaçlardan yumurtaya mikropların direkt geçmesi) veya horizontal (yatay) kabuktan içeri girmek suretiyle bulaşabilirler. Bu mikroorganizmalar kuluçkalanma sırasında çoğalarak embriyoyu infekte edebilir, embriyo ölümlerine, infekte civcivlerin çıkmasına ve civciv ölümlerine yol açarlar. Hatta, en tehlikeli olanı da, yumurtadan hazırlanan aşılara da bulaşarak infeksiyonlara neden olurlar. Yumurta sarısında bulunan maternal antikorlar, virusların üremesini inhibe edebilirler. Bu nedenle de viral çalışmalarda (izolasyon, aşı üretimi, vs.) maternal antikor taşımayan yumurtaların tercih edilmesi zorunludur. Bunu belirlemek için Hemaglutinasyon inhibisyon (Hİ), AGP, NT veya diğer testlerden yararlanılabilir.

Embriyolu yumurtalara yapılan ekim yerleri değişiktir. Virusun karakterine göre değişmek üzere, korioallantoik membran üzerine (HSV-1, -2; Çiçek virusları, kanatlıların ILT virusu, vs.) korioallantoik keseye (Newcastle, influenzae, parainfluenza, kabakulak, IB, EDS-76, vs.), sarı kesesine (kuduz, arboviruslar, vs.) ve amnion kesesine (kabakulak) ekimler yapılır. Embriyonun yaşı da, sıra ile, gün olarak, 9-11; 8-10; 7-8; 8-9 arasında değişebilir. Ancak, bu limitler kesin bir kural değildir. Virusun karakterine bağımlı olarak ayarlanabilir.

Embriyolu yumurtalara ekim yerleri yandaki şekilde gösterilmektedir.

Çiçek virusları membran üzerinde lezyonlar (pock; oval, yuvarlak) meydana getirmesine karşılık, I.bronchitis virusu embriyolarda küçülmelere, büzülmelere, hemorajilere, membranda kalınlaşmalara ve embriyo ölümlerine yol açar. Newcastle virusu 2-4 gün içinde ölümlere, membranda kalınlaşmalar ve hemorajiler ve aynı zamanda allantoik sıvıda hemaglutininlerin oluşmasına neden olur. Bazıları da embriyoları öldürmeyebilir (Newcastle HBI aşı virusu, EDS-76). Ancak, EDS-76 virusu ördek yumurtalarında ürer ve hemaglutinin oluşturur. Hindi, kaz, ve diğer hayvanların yumurtaları da bu kanatlıların viral hastalıklarında kullanılabilirler. Yukarda bahsedilen 4 temel ekim yerinin dışında, embriyoların beynine ve kas içine de inokulasyonlar da yapılabilir.

Bakteri virusları (bakteriyofaj) ve bitki virusları embriyolarda ürememektedirler.

Virusların üretiminde yumurta kullanımının bazı avantajları (ucuz ve kolay bulunması, bol viral materyal elde edilmesi, virusların kolay üremeleri, çeşitli virolojik çalışmalarda kullanılması, izolasyon, teşhis, aşı üretiminde fazla kullanılması, vs.) yanı sıra bazı dezavantajları da (viral ve bakteriyel kontaminasyonlar, aşılara bulaşma, maternal antikorlar) bulunmaktadır.

Embriyolu yumurtalar aynı zamanda değişik virusların üremesine yardımcı olan farklı tipte hücrelere de (fibroblast, epitel hücreleri ve çeşitli organ hücreleri) sahiptirler. Ayrıca, hücre kültürleri için de iyi bir hücre kaynağıdırlar. Tavuk embriyoları bazı insan hastalıklarına ait virusların (yellow fever, influenzae, small pox, vs.) üretiminde de kullanılmışlardır. 

Virusların titrelerinin belirlenmesinde embriyolu yumurtalardan fazlaca yararlanılmaktadır. Örn., %50 Embriyo İnfektif Doz (EİD50), %50 Embriyo Letal Doz (ELD50); %50 Pock forming unite (Pfu50 ) gibi.

İnokulasyondan sonra, genellikle, ikinci günden itibaren ölen embriyolar buzdolabına kaldırılarak 4-6 saat kadar bekletildikten sonra, steril koşullar altında ve usulüne uygun olarak açılır ve gerekli materyaller alınır. Aynı zamanda, embriyo ve membranlar dikkatlice muayene edilerek görülen değişiklikler kaydedilir.

Kontaminasyonların olacağını düşünerek bu yönden gerekli kontrollerin yapılması şarttır.

Hemaglutinasyon yeteneğine sahip viruslarda, özellikle, allantoik sıvının lâm üzerinde, çabuk HA yönünden kontrolü gereklidir.

Açılan yumurtalardan alınan materyallerden hazırlanan inokulumlar, ikinci bir pasaj amacı ile kullanılırlar.  

03. Hücre Kültürleri

Virusları izole etmede, üretmede, aşıların hazırlanmasında, serolojik testlerde, titre tayinlerinde ve diğer virolojik çalışmalarda hücre kültürleri, embriyolu yumurtalardan daha fazla kullanılmaktadır.

Hücre kültürlerinin tüp veya şişelerde hazırlanması kolay ve ucuz olduğu gibi, istenildiği durumlarda pasajı da yapılabilir. Kültürlerde üretme, idame ve diğer amaçlar için kullanılan besi yerlerinin hazırlanması ve sterilizasyonu da zor değildir. Konu üzerinde deneyimi olan kişilerin kullanılması hücre kültürü hazırlama da kolaylık sağlamaktadır. Hücrelerde virus üremelerini ortaya koyan sitopatik effektleri (CPE), fokusları, sinsitia oluşumunu ve inklusiyon cisimciklerini görmek kolaydır. Çeşitli tipte hücreleri (fibroblast, epitel hücreleri, vs.) kullanmak, farklı virusların üretilmesine seçenek sağlamış olur.

Virus çalışmalarında kullanılan hücreler başlıca 3 grupta toplanırlar (primer kültür, celline ve devamlı hücre kültürleri).

Primer hücre kültürleri:Genellikle normal embriyo veya konakçı dokularından sağlanan hücrelerle hazırlanır. Bu amaçla, tavuk, fare, maymun, koyun, sığır, hamster embriyoları veya neonatal hayvanlar kullanılır. İnsanların gingival, vs. dokularından da bu amaçla yararlanılmaktadır. Hücre kültürlerinin hazırlanması bazı aşamalarda gerçekleşir ve genellikle tripsinizasyon esasına dayanır. Bu tarzda elde edilen kültürlere primer hücre kültürü adı verilir. Eğer, primer kültür hücrelerinin pasajı yapılırsa bunlar sekonder hücre kültürleri olarak tanımlanırlar. Ancak, primer ile sekonder hücre kültürleri arasında viruslara karşı duyarlılık değişebilir veya farklı olabilir. Onun için viral çalışmalarda buna dikkat etmek gerekir. Normal hücrelerin de ancak (ve en fazla), hücre türüne göre değişmek üzere, 3-8 pasajı yapılabilir. Bu hücreler orijinal kromozom sayısını muhafaza ederler.

Primer kültürler için, genellikle, çok fazla üreme potansiyeline sahip olan embriyonal veya neonatal hayvan hücreleri tercih edilirler.

Fibroblastlar, genellikle, mekik benzeri ve düzensiz üremelerine karşın epitel hücreleri daha düzgün, yan yana, poligonal bir morfolojide ve tek katlı hücre tabakası (monolayer) oluşturarak ürerler. Epitel hücreleri, fibroblastlardan çoğu zaman daha duyarlıdır ve daha geç ürerler. Böbrek hücre kültürleri epitel hücre kaynağı olması bakımından tercih edilirler.

Cell lineler: Bunlar 20-30 pasaja kadar herhangi bir kromozomal ve morfolojik değişikliğe uğramadan üreyebilirler. Viral çalışmalarda çok kullanılan özel hücre hatlarıdır.

Cell-lineler primer kültürlerden elde edilebilirler. Ancak, sınırlı üreme potansiyeline sahip hücrelerdir. Laboratuarda devam ettirilmesi ve kullanılması oldukça kolaydır. Pratikte daha ziyade devamlı hücre kültürlerinden yararlanılır. Hali hazırda kullanılan birçok hücre hattı bulunmakta ve çeşitli ülkelere belli merkezlerden (hücre bankalarından) gönderilmektedir. Cell-line'lerden insan        (Hep-2, KB), sığır (MKC), hamster (BHK-21), kanatlı, maymun (vero) orijinli olanlar virusların izolasyon ve diğer virolojik çalışmalarda kullanılmaktadır.

Devamlı hücreler:Normal hücrelerin mutasyonları sonu veya kanser hücrelerinden (Hela, vs.) elde edilirler ölümsüz hücrelerdir. Sonsuz pasajı yapılabilir. Değişik türde hücrelere sahiptirler ve kültür şişelerine zayıf bağlanırlar. Ancak, kısa sürede monolayer oluşturduklarından, zaman geçirmeden pasajı yapılmaktadır. Bazı suşlar süspansiyon halinde üreyebilirler (BHK).

Organ hücre kültürleri: Embriyonal karakterdeki organlardan elde edilen hüre süspansiyonlarıdırlar. Bazen organ eksplantları da kullanılabilir.

Diploid hücreler:Bunlar primer kültürlerden orijin almışlardır. Bunların 50-100 defa pasajı yapılabilir. Normal diploid karyotiplere sahiptirler (WI 38, SIRC, vs.).

Viruslar üredikleri hücrelerde, morfolojik değişikliklere (yuvarlaklaşma, şişme, dejenerasyonlar ve camdan ayrılarak besi yerlerine dökülmelere yol açar ki böyle bozukluklara sitopatik effekt (CPE) adı verilir. Eğer hücrelerde parçalanma ve ölümler oluşuyorsa sitosidal (litik) etki adını alır (enterovirus, reovirus, vs.). Buna karşın bazı viruslarda (persistens infeksiyonlar) nonsitosidal (nonlitik) olup herhangi bir hücre dejeneresyonu göstermezler (gençlik hastalığı, bazı myxoviruslar, vs.). Bir kısım viruslar da (tümör, retrovirus) onkojenik formasyonlar (fokal bozukluklar) meydana getirirler. Paramyxoviruslar, herpes viruslarda sinsitia (veya dev hücre, polikaryosit) oluştururlar. İntranukleer (herpes virusları) ve intrasitoplasmik inklusiyon cisimcikleri de hücre kültürlerinde görülebilirler. Hücrelerde oluşan bozukluklar mikroskop altında kolayca gözlenebilir. Bu amaçla nötral red veya hematoxylen boyasından yararlanılabilir.

Hücrelerde hiçbir bozukluk yapmayan virusların ürediklerini hemaglutinasyon, hemadsorbsiyon veya interferens testleriyle ortaya koymak mümkün olabildiği gibi serolojik testlerden de yararlanılabilir.

Virusları üretmede öncelikle kendi konakçısına ait hücreler (primer, sekonder, cell line, vs. hücre kültürler) tercih edilir. Çünkü, daha iyi, kolay ve bol üreyebilirler. Bazı durumlarda insanlara (veya hayvanlara) ait bir virus insan orijinli hücreler yanı sıra memeli veya kanatlı hayvanlara ait hücrelerde de üreyebilirler.

Bazı viruslar, genellikle, hücrelerde dejenerasyon yapanlar, monolayer hücre kültürlerinde de, agar tabakası altında, plaklar oluştururlar. Bu plaklar gözle görülebilir ve boyanarak da daha belirgin hale getirilebilirler. Plaklar sayılarak orijinal virus süspansiyonundaki plaque forming uniteler (pfu) belirlenebilir.

Virusların titrasyonunda da hücre kültürlerinin önemli fonksiyonları vardır. Hücrelerde oluşan CPE'lere göre virusun titresi ve %50 infektif dozu (ID50) hesaplamak mümkündür.

Cell-line'ler ve devamlı hücreler genellikle, mutasyonlar veya tümör hücrelerinden kaynaklandığı için, normal hücrelerden biraz farklı karaktere sahiptirler. Böyle hücreler insan aşısı üretiminde pek kullanılamazlar. Duyarlılıkları da değişiktir.

Bazen ilk izolasyonlarda hücrelerde bir dejenerasyon gözlenemez. Ancak, müteakip pasajlarda hücrelerde CPE ortaya çıkar.

Doku kültürleri virusların attenüasyonları için de kullanılabilirler.  

04. Deneme Hayvanları

Bazı  viruslar embriyolu yumurtalarda veya doku kültürlerinde üremezler, veya çok zayıf ürerler. Böyle durumlarda laboratuvar hayvanlarından (fare, kobay, hamster, tavşan, maymun, vs.) yararlanılır. Deneme hayvanları izolasyon, identifikasyon immunolojik araştırmalarda ve aşıların kontrollerini yapmada fazlaca kullanılırlar.

Viruslar deneme hayvanlarında infeksiyonlar veya ölümler meydana getirirler buna göre %50 fare infektif doz(FID50) veya %50 fare letal doz (FLD50) leri hesaplamak mümkündür.

Viral çalışmalarda kullanılan küçük laboratuvar hayvanlarının specific pathogen free (SPF) karakterde olması, hayvanların duyarlılığını artırır ve daha güvenli sonuçlar verir. Konvansiyonel hayvanların kullanımı, zorunlu değilse, düşünülmemelidir. Çünkü, konvansiyonel hayvanların kanlarında antikor bulunacağı gibi, sindirim, solunum ve ürogenital sistemlerinde patojenik mikroorganizmalar vardır. Bu etkenler, stres hallerinde üreyerek infeksiyon oluşturabilir ve denemeleri yanıltır veya başka yöne sürükler.

Virusların attenüasyonlarında da deneme hayvanlarından fazlaca yararlanılır.

Deneme hayvanları kullanılmadan önce sağlık yönünde iyi bir kontrolden geçirilmeleri gereklidir. Hayvanlarda açık veya herhangi bir gizli infeksiyon veya kanlarında antikor bulunmamalıdır. Hayvanlar tam sağlıklı olmalıdırlar.

Deneme hayvanlarına injeksiyonlar derialtı, kas içi, damar içi, beyin içi, vs. yollardan biri ile yapılır.

Denemeye alınan hayvanlar her gün kontrolden geçirilerek, sağlıklarında görülebilecek düzensizlikler, klinik belirtiler ve ölümler kaydedilir. Gerektiğinde infekte veya ölen hayvanlardan deneme inokulasyonları yapılır veya virüs izole edilmeye çalışılır.

Vücutlarında herhangi bir mikroorganizma ve kanlarında antikor bulunmayan Germ free (mikropsuz) hayvanlar ancak çok önemli çalışmalarda kullanılırlar. Bunların üretim, bakım ve germ free koşullarının idamesi oldukça dikkat, beceri, zahmet ve zaman ve para isteyen bir uğraştır.

[1]Kaynak : Temel Mikrobiyoloji


Bu sayfa 19285 kez okundu.
Sayfayı Yazdır    Adobe Acrobat Reader Adobe Acrobat Reader