Membran Filtrasyon
01. Genel Bilgiler
02. Por Kavramı
03. Manifold ve Vakum Pompası
04. Membran Filtrasyonda Kullanılan Besiyerleri
05. Seyreltme ve Taşıma Suyu Örnekleri
06. Standart Uygulama
01. Genel Bilgiler
Membran filtrasyon asıl olarak, analiz edilecek materyali, sporlar dâhil olmak üzere bakterilerin, mayaların ve küflerin geçemeyeceği kadar küçük gözenekleri olan analitik filtreden geçirerek (bir anlamda süzerek) mikroorganizmaları bu filtre üzerinde tutmaktır. Gıda ve su mikrobiyolojisi standart uygulamalarında virüsler filtre altına geçerler. Özel uygulamalarda virüslerin filtre üzerinde tutulacağı daha düşük porlu çok özel membran filtreler vardır.
02. Por Kavramı
Membran filtreler, Almanya’daki Göttingen Üniversitesinde 1925 yılı Nobel Kimya Ödülünü alan Prof. Dr. Richard Adolf Zsigmondy tarafından icat edilmiştir. Selüloz nitrat ve karışık ester membran filtre çeşitleri vardır. Membran filtrasyonda amaca göre 0,1-8 µm porlu filtreler kullanılır. Por, çay süzgeci örneğinde olduğu gibi standart gözenek çapı değildir. Bir su borusunun çapı, boru boyunca sabittir. Doğal bir derenin genişliği ise her yerde aynı değildir. Dereyi, üstü kapalı doğal bir su borusu olarak düşünelim. Sonuçta sıvının geçebileceği en dar çap, por olarak tanımlanır. Fitrenin poru, standart yöntemlerle mekanik olarak kontrol edilebilir.
Membran filtrasyon yöntemi, 20 mL ve daha fazla hacimlerde ve analiz edilen su numunesi miktarında çok az sayıda (~<20 KOB/mL) hedeflenen mikroorganizma varsa uygulanır. Daha yüksek sayılarda mikroorganizma varlığında (~>20 KOB/mL) ya seyreltme yapılır ya da EMS yöntemine veya standart dökme/yayma kültürel sayım yöntemlerine başvurulur. İnsani tüketim amaçlı suların mikrobiyolojik analizinde membran filtrasyon yöntemiyle kontrol edilen tüm bakterilerde analiz edilen miktardaki suda 0 KOB/analiz edilen hacim olması istenir.
İnsani tüketim amaçlı suların mikrobiyolojik analizinde, toplam koloni sayımı dışındaki bütün bakteri analizleri membran filtrasyon yöntemiyle yapılır. Çünkü analiz yapılan miktarlar 50-250 mL’dir ve bu miktarların analizi için membran filtrasyon en uygun yöntemdir.
03. Manifold ve Vakum Pompası
Basitçe, su numunesi steril bir manifolda (özel bir huni benzeri hazneye) aktarılır, standart olarak kullanılan 0,45 µm por çaplı steril bir membrandan geçirilir, membran uygun bir katı besiyerine yerleştirilir. Besiyerine yerleştirmede membranın, suyun süzüldüğü yüzeyi üste gelmelidir. Filtre üzerinde tutulmuş mikroorganizmalar, besin maddelerini bir anlamda emerek beslenir ve koloni oluştururlar.
Analizi yapılacak suyun aktarıldığı manifold paslanmaz çelik ya da plastik olabilir. Paslanmaz çelik gövde otoklavda ya da Bunsen beki alevi ile sterilize edilebilir. Plastik gövdelerin steril tek kullanımlık olanları ve otoklavda sterilize edilebilen çeşitleri vardır.
Suyun filtreden süzülmesi için vakum uygulanmalıdır, aksi halde su filtreden geçmez. Vakum pompası motoruna filtrasyon sırasında su kaçmamalıdır. Eski sistemlerde filtre edilen suyun toplandığı ve pompa ile manifold arasında duran bir erlen vardı. Modern sistemlerde klasik vakum pompası yerine peristaltik pompa kullanılarak erlen kullanımına gerek kalmamıştır. Süzülen su, doğrudan lavaboya gönderilir.
04. Membran Filtrasyonda Kullanılan Besiyerleri
Filtrasyon sonrası sayım ve/veya var/yok analizi amacıyla kullanılan membran filtrenin yerleştirileceği besiyeri, koloni gelişmesine uygun olmalıdır. Bu aşamada doğal olarak standart mikrobiyolojik analiz doğrultusunda akla ilk gelen agarlı besiyerleridir. Ancak, standart olarak agar içermeyen ve koloni gelişmesini sağlayan farklı sistemler de vardır ve bunların en tipik örneği 3M PetriFilmdir.
Filtrasyon sonrası membran filtre yaygın kullanıldığı şekli ile 4 farklı besiyerine yerleştirilebilir:
-Standart agarlı besiyeri: Örneğin, koliform/E. coli analizinde standart olarak kullanılan Chromogenic Coliform Agar (CCA), laboratuvarda standart şekilde hazırlanıp Petri kutularına dökülebilir ya da Petri kutusuna dökülmüş olarak tedarikçiden sağlanabilir. Bu tercih, tümüyle laboratuvar ekonomisi ile ilişkilidir. Bilimsel araştırmalarda laboratuvar, kullanacağı besiyerini kendisi kompoze edebilir.
-Kullanıma hazır pedli besiyeri: Besiyeri, absorban pede emdirilir, kurutulur, plastik bir Petri kutusuna yerleştirilir ve sterilize edilir. Bu hazır pede filtrasyon öncesinde 3-3,5 mL steril su ilave edilip bir anlamda ped aktive edilir. Filtrasyon sonrasında membran filtre bu ped üzerine konulur. Bilimsel amaçlı çalışmalarda pede ilave edilen 3-3,5 mL steril su yerine farklı kimyasal bileşimlerdeki steril su da kullanılabilir. Standart laboratuvar uygulamasında kullanıcı dostu olarak tanımlanmaktadır.
-Kullanıma hazırlanacak pedli besiyeri: Boş bir absorban ped, plastik bir Petri kutusuna yerleştirilip sterilize edilir. Filtrasyon öncesinde üretici firma tarafından sunulan 2 mL hacımdaki plastik şişecik içindeki steril sıvı besiyeri, pede ilave edilerek aktivasyon sağlanır. Steril pede ilave edilecek sıvı besiyeri, laboratuvar ortamında da hazırlanabilir. Bilimsel aştırmalarda farklı besiyerleri kompoze edilebilir. Standart uygulamada kullanıma hazır pedli besiyerine kıyasla soğukta muhafaza ve daha kısa raf ömrü dezavantajları vardır.
-3M PetriFilm ve benzeri ürünler, membran filtrelerin yerleştirilmesi için kullanılmaktadır.
Membran filtrasyon sonrası membran filtrenin yerleştirileceği ve inkübasyona bırakılacağı besiyerleri, tümüyle laboratuvar ekonomisine ve operatrislerin alışkanlığına bağlıdır.
İnsani tüketim amaçlı suların standart analizinde Salmonella analizi yoktur. Salmonella analizi gerekirse, amaca uygun miktarda su numunesi filtre edilir. Filtre, doğrudan selektif katı besiyerine ya da pedli selektif besiyerine yerleştirilebilir. Eğer numunede aktif Salmonella varsa doğrudan selektif katı besiyerinde gelişerek koloni oluşturur. Ancak, eğer Salmonella hasar görmüş ise selektif katı besiyerinde gelişip koloni oluşturamaz ve böylece sahte negatif sonuç alınır. Filtrenin, 30-40 mL Tamponlanmış Peptonlu Su besiyerine bırakılarak ön zenginleştirme ile standart yöntemle devam edilmesi koşulunda bu sorun kaldırılmış olur. Benzer uygulamalar Listeria monocytogenes ve E. coli O157:H7 analizleri için de geçerlidir.
Membran filtrasyon uygulamaları hakkında www.mikrobiyoloji.org sitesinden ücretsiz ve şifresiz olarak indirilebilen Gıda Mikrobiyolojisi 2019 kitabında ayrıntılı bilgi vardır
Gıda mikrobiyolojisinde ve suların mikrobiyolojik analizinde yaygın olarak 0,45 µm porlu filtreler kullanılır. İçme ve kullanma sularının Clostridium sporlarının analizinde 0,2 µm porlu filtreler ile maya ve küf analizinde 8 µm porlu filtreler kullanılır. 8 µm porlu filtreler partiküllü numunelerin analizinde ön filtre olarak da kullanılır. 0,2 µm porlu filtreler ise bakteriyofaj analizlerinde kullanılır. Bakteriyofaj analizlerinde konakçı hücrenin tam olarak filtre üzerinde tutulması ve sadece bakteriyofajların filtre altına geçmesi amaçlanır.
Bu tanımlamalara göre standart membran filtrasyon, virüsler (bakteriyofajlar) dışında kalan mikroorganizmaların, standart mikrobiyolojik analizleri için yeterlidir.
Endüstride ve mikrobiyoloji laboratuvarda membran filtrasyon sistemi farklı amaçlarla kullanılır:
-Gıda (su), endüstriyel boyuttaki membran filtrelerden geçirilerek bir anlamda sterilize edilir. İçme suları, pastörize edilmemiş bira vb. içecekler bu şekilde mikroorganizmalardan arındırılır.
-Mikrobiyolojide kullanılan bazı besiyerlerinin bileşimine giren bazı vitaminler, aminoasitler ve antibiyotikler ısıya dayanıksızdırlar ve otoklavlama sırasında kimyasal yapıları bozularak kendilerinden beklenen işlevi gerçekleştiremezler. Bu gibi besiyeri katkıları, çözelti halinde membran filtreden geçirilerek otoklavda sterilize edilmiş besiyerine yeteri kadar soğutulmuş bir sıcaklıkta (sıvı besiyerlerinde oda sıcaklığında, agarlı besiyerlerinde ~45 oC) eklenir.
Membran filtrasyon sistemi özellikle içme ve kullanma suyu ile pek çok meşrubat, bira, şarap ve berrak meyve suları gibi filtrasyonda sorun çıkarmayan ve çok az sayıda mikroorganizma bulunabilen numuneler için idealdir. Benzer şekilde gerekirse suda tam olarak eriyebilen şeker ve tuz gibi gıdaların analizinde de kolaylıkla kullanılmaktadır. Hava ve endüstriyel gazlar da yine membran filtrasyon yöntemiyle sterilize edilebilir. HEPA filtreler farklıdır ve membran filtrasyon yerine geçmez.
Suyun mikrobiyolojik analizlerinde geliştirilen en mükemmel yöntemlerden birisi olan membran filtrasyon tekniğinde, 1-2 mL yerine çok daha büyük hacimlerde numune analizi yapılabilmektedir. Böylece numunenin çok az sayıda mikroorganizma içermesi halinde bile, bunun belirlenme imkânı sağlanır.
Membran filtrasyon yöntemi ile sayımın ilkesi, analiz edilecek materyaldeki mikroorganizmanın analitik filtre üzerinde tutulmasına dayanır.
Tekniğin esası, laboratuvara gelen numuneden belirli bir hacmin membran filtreden geçirilmesine dayanır. Filtrenin gözenek büyüklüğü (por çapı), numunedeki mikroorganizma boyutundan daha küçüktür. Dolayısı ile filtrasyon sırasında mikroorganizmalar filtre üzerinde tutulur. Daha sonra bu filtreler amaca uygun bir besiyeri üzerine, arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilir. Petri kutuları, gerekli görülen sıcaklıkta ve sürede inkübasyona bırakılır, inkübasyon sonunda oluşan koloniler değerlendirilir.
İnsani tüketim amaçlı suların mikrobiyolojik parametreler açısından analiz edilmesi ve sağlık koşullarına uygunluğunun denetlenmesi, su kaynaklı bulaşıcı hastalıkların önlenmesi açısından önemlidir. Ciddi bir halk sağlığı problemi oluşturabilecek bu hastalıkların önlenebilmesi açısından uluslararası kabul görmüş analiz yöntemleri vardır.
Standart mikrobiyolojik analiz kuralları uyarınca membran filtrasyon yöntemi, 1 KOB/mL'den daha az sayıda mikroorganizma içeren numunelerin analizi için en uygun yöntemdir. Bununla birlikte pratik kullanımı nedeni ile mikrobiyoloji laboratuvarında gerekirse bundan çok daha fazla sayıda mikroorganizma içeren numunelerin analizinde de kullanılabilmektedir. Bu gibi numunelerin membran filtrasyon ile analizinde yeterli bir seyreltme yapılarak çalışılır.
İçme ve kullanma suyu analizinde genellikle 100 ya da 250 mL su numunesi filtre edilir. Filtreyi ıslatmak amacıyla önceden ilave edilen steril su miktarı önemli değildir, burada sadece 100/ 250 mL numunenin filtre edildiği dikkate alınmalıdır. Bu içme/ kullanma suyu yüksek miktarda klorlanmış ise klor da filtre üzerinde kalıp mikroorganizma gelişmesini baskılayabilir. Bunun önüne geçmek için analiz edilecek numune filtreden geçirildikten sonra, bol miktarda steril su ya da özel olarak bu amaçla hazırlanmış Membrane Filter Rinse Fluid (Merck 105286) geçirilerek filtre bir anlamda yıkanır.
Filtrasyon sonunda membran filtre, üretici firma tarafından sağlanan ve özel olarak üretilmiş besiyerine veya laboratuvarda standart olarak hazırlanan ya da kullanıma hazır olarak sağlanan katı besiyeri üzerine yerleştirilebilir.
Kayısı suyu, portakallı meşrubat gibi partiküllü numuneler ya da tam yağlı süt gibi numunelere membran filtrasyon uygulanamaz. Bu gibi numuneler filtreyi tıkar. Ön filtre ve enzim uygulaması ile bu sorun kısmen giderilebilse de özellikle enzim uygulaması pratik uygulamada geçerli değildir. Ön filtre uygulamasında homojenizat ya da sıvı gıda, asıl filtrenin üzerine yerleştirilen 8 µm porlu filtreden geçirilir, kaba parçalar burada tutulur. Bu filtrenin de ayrı bir besiyerine yerleştirilmesi ve inkübasyon sonunda her iki filtreden elde edilen sonucun toplanması gerekir. Ön filtre uygulaması partiküllü tüm numuneler için kesin çözüm değildir.
05. Seyreltme ve Taşıma Suyu Örnekleri
Membran filtrasyon yönteminin asıl olarak çok az sayıda mikroorganizma içeren numuneler için ideal olduğu yukarıda anlatılmıştı. Ancak, bazı laboratuvarlarda donanım yetersizliği nedeniyle kirli sular da membran filtrasyon yöntemiyle analiz edilir. Bu uygulamada kirli su numunesi standart yöntemle seyreltilerek analiz edilir.
Örnek: Bir su numunesinden E. coli sayımı amacıyla 1 mL alınıp 9 mL steril seyreltme çözeltisine aktarılmıştır. Toplam 10 mL olan bu sıvının tamamı, filtreye yeknesak bir dağılım için 45-50 mL kadar steril su (tercihen steril seyreltme çözeltisi) olan bir kaba aktarılmış, elle karıştırıldıktan sonra standart şekilde membran filtrasyon uygulanmıştır. İnkübasyon sonunda 14 tipik E. coli kolonisi sayılmıştır. Su numunesinin mL’sindeki E. coli sayısı nedir?
Yanıt: 14 KOB/mL. Bu soruda çoğu kişi 1:9 standart seyreltme yapıldığını düşünerek 140 KOB/mL olarak yanıt verir. Ancak dikkat edilirse manifolda orijinal su numunesinden sadece 1 mL aktarılmıştır. Aslında çalışma yanlış planlanmıştır. 1 mL su numunesinin 9 mL steril seyreltme çözeltisine aktarılması ve toplam 10 mL çözeltisinin 45-50 mL steril seyreltme çözeltisine aktarılması yerine doğrudan 45-50 mL steril seyreltme çözeltisine aktarılması aynı şeydir: Sadece 1 mL orijinal su numunesi filtre edilmiştir.
Soru şöyle olsa idi: Bir su numunesinden E. coli sayımı amacıyla 1 mL alınıp 9 mL steril seyreltme çözeltisine aktarılmıştır. Toplam 10 mL olan bu sıvıdan 1 mL alınıp, filtreye yeknesak bir dağılım için 45-50 mL kadar steril su (tercihen steril seyreltme çözeltisi) olan bir kaba aktarılmış, elle karıştırıldıktan sonra standart şekilde membran filtrasyon uygulanmıştır. İnkübasyon sonunda 14 tipik E. coli kolonisi sayılmıştır. Su numunesinin mL’sindeki E. coli sayısı nedir? Yanıt şimdi 140 KOB/mL’dir çünkü manifolda orijinal su numunesinden 0,1 mL aktarılmıştır.
Bu örnekte 45-50 mL kadar olan steril seyreltme çözeltisinden bahsedilmektedir. Bu steril çözeltinin hacmi önemli değildir. 90-100 mL’de olabilirdi. Çünkü bu steril çözelti sadece filtre üzerinde yeknesak bir mikroorganizma dağılımının sağlanması amacıyla kullanılmaktadır.
1 mL su numunesinin doğrudan manifolda aktarılıp vakum pompasının çalıştırıldığını var sayalım. Bu miktarda su, membran filtreden geçecektir ancak, filtre üzerinde yeknesak bir şekilde dağılmayacağı için koloniler çok muhtemelen sağlıklı bir şekilde sayılamayacaktır. İnkübasyon sonunda 0 KOB/mL ya da 1 KOB/mL sonuçları geçerlidir, fakat her zaman böylesi sonuçlar alınamaz.
Bu aşamada seyreltme ve taşıma suyu ayrıntısına dikkat çekilmektedir. Yukarıda verilen örnekte 45-50 mL steril taşıma suyu anlatılmıştı.
Örnek: Uluslararası ticarette 100 mL elma suyu konsantresinde Alicyclobacillus spp. istenmemektedir.
Yanıt: Elma suyu konsantresine doğrudan membran filtrasyon uygulanamaz. Her koşulda bu konsantrenin sulandırılarak membran filtreden geçirilebilecek fiziksel forma dönüştürülmesi zorunludur. Bu amaçla 100 mL elma suyu konsantresi yeteri kadar hacimde steril seyreltme çözeltisi içinde elle dahi karıştırılarak homojeniz edilir ve membran filtreden geçirilir. “Yeteri kadar hacim” işletme deneyimine bağlıdır, 100 mL ya da 2 L. Hiç önemli değildir, bu taşıyıcı çözelti, steril olduğu için Alicyclobacillus spp. içermemektedir. Filtre edilen miktar sadece 100 mL elma konsantresidir.
Filtrasyon sonrasında filtre, 45-50 mL hacimde ve amaca uygun bir genel/ selektif sıvı besiyeri olan erlenin içine atılır ve standart var/yok yöntemiyle analiz devam eder.
06. Standart Uygulama
Membran filtrasyon sistemi sterilize edilir. Sterilizasyon işlemi, ekipmanın özelliğine göre otoklavda yapılabildiği gibi, pratik olarak %76 alkol ya da uygun bir kimyasal kullanılarak da yapılabilir. Otoklavlama parametresi 121 °C'ta 30 dakika iken, kimyasal dezenfeksiyon uygulanırsa dezenfektanın kolaylıkla sistemden uzaklaştırılması gerekir. Aksi halde sistemde kalan dezenfektan, analizi yapılacak mikroorganizma üzerinde olumsuz etki oluşturur. Bu nedenle, alkol uzaklaştırıldıktan sonra kalan kısmının yakılarak giderilmesine ek olarak, analiz öncesinde 50 mL kadar steril damıtık suyun filtre edilmesi, sistemde kalabilen dezenfektanın yıkanması için etkili bir uygulamadır.
Standart yöntemde aseptik koşullara uyularak filtrenin yerleştirileceği taban steril su ile ıslatılır ve filtre buraya yerleştirilir. Koruyucu plastik tabaka kendiliğinden kalkar, bu kısım filtreden ayrılır. Sonra süzme haznesi yerine takılır. Beklenen ya da hedef sayıya uygun miktarda sıvı analitik huniye konulur, pompa çalıştırılır ve numune membran filtreden geçirilir. Filtre;
-Steril sıvı besiyeri ile ıslatılmış absorban pet üzerine,
-Steril su ile ıslatılmış besiyeri içeren absorban pet üzerine,
-Agarlı besiyeri üzerine mikroorganizmaların tutunduğu yüzey üstte olacak şekilde yerleştirilip, hedef mikroorganizmaya uygun sıcaklık ve sürede inkübasyona bırakılır.