Suların Mikrobiyolojik Analizi
01. Genel Bilgiler
02. İçme ve Kullanma Sularında Toplam Koloni Sayımı
03. İçme ve Kullanma Sularında Membran Filtrasyon Esaslı Analizler
04. Sularda Özel Mikrobiyolojik Analizler
05. Seyreltme ve Taşıma Suyu
06. Kullanılmış Malzemenin Sterilizasyonu
01. Genel Bilgiler
Gıda mikrobiyolojisinde olduğu gibi suların da mikrobiyolojik analizinde farklı analiz yöntemleri ve dolayısıyla farklı besiyerleri kullanılır. Bu analizlerde de izin verilen mikroorganizma sayısına göre analiz yöntemleri değişir. İçme ve kullanma sularında geçerli olan yönetmeliğe göre toplam koloni sayısı dökme kültürel sayım yöntemiyle, diğer tüm analizler membran filtrasyon yöntemiyle yapılır. İnsani tüketim amaçlı suların analizinde örneğin Salmonella analizi yoktur. Gerekirse sularda Salmonella analizi farklı yöntemlerle yapılır. Bu gibi özel analizler, bu dosyanın 04. Bölümünde verilmiştir.
02. İçme ve Kullanma Sularında Toplam Koloni Sayımı
İnsani tüketim amaçlı suların mikrobiyolojik analizinde 22 oC ve 37 oC inkübasyon sonundaki “toplam koloni sayısı” belirlenmesi dışındaki tüm bakteriyolojik analizlerde, analiz edilen numune miktarının yüksek hacimde olmasına bağlı olarak membran filtrasyon sistemi kullanılması gerekirken “toplam koloni sayısı” belirlenmesi, ilgili yönetmeliğe bağlı olarak standart dökme kültürel yöntemle yapılmalıdır. Standart dökme kültürel yöntemi bu sitenin ana sayfasında görülen ve bilgisayarlara şifresiz ve ücretsiz olarak indirilebilen “Gıda Mikrobiyolojisi 2019” kitabının 07.06.01.02. Dökme Plak Yöntemi bölümünde ayrıntılı olarak verilmiştir.
Bu grup sularda, 22 oC ve 37 oC inkübasyon sonunda iki farklı toplam mezofilik aerobik koloni sayım limitleri vardır. Hiçbir koşulda “22 oC ya da 37 oC inkübasyon sonunda bu iki değerden biri diğerinden yüksek olur” şeklinde bir kural yoktur. İlgili yönetmelikte 22 oC inkübasyon sonunda izin verilen “toplam koloni sayısı” 37 oC inkübasyon sonunda izin verilen “toplam koloni sayısına” kıyasla daha esnektir. Aynı işletmede bir gün 22 oC’taki toplam koloni sayısı> 37 oC’taki toplam koloni sayısı, ancak ertesi gün 37 oC’taki toplam koloni sayısı> 22 oC’taki toplam koloni sayısı olabilir.
Her ne kadar “toplam mezofilik aerobik koloni” sayımında dökme yöntemi kullanılması ile ilgili uluslararası (ISO) standart varsa da tesadüfen Petri kutusunun tabanına düşmüş bakterilerden zorunlu aerop olanların, kısıtlı oksijen varlığı nedeniyle yeterli bir şekilde gelişip koloni oluşturama endişesi de vardır. Ancak, bu metinde uluslararası kabul görmüş standartların eleştirilmesi amacı yoktur.
Kimi su işletmelerinde yeterli laboratuvar donanımı bulunmadığı için adı geçen yönetmelikte belirlenen “toplam koloni sayısı” da membran filtrasyon yöntemiyle kontrol edilmektedir. Bu amaçla 1 mL su numunesi membran filtreden geçirilip uygun bir besiyeri üzerinde inkübasyona bırakılır. Bu yöntem standarda uygun değildir, ancak su numunesinin genel bakteriyolojik kalitesi hakkında bilgi verir. 1 mL su numunesi membran filtrasyon sisteminde doğrudan analize alınamaz. Bu klasörün “membran filtrasyon” dosyasının “05. Seyreltme ve Taşıma Suyu Örnekleri” başlığı altında anlatıldığı şekilde analiz edilir.
03. İçme ve Kullanma Sularında Membran Filtrasyon Esaslı Analizler
Yönetmelik gereği olarak; toplam koliformlar, E. coli, enterokoklar, Pseudomonas aeruginosa, patojen stafilokoklar, anaerop sporlu sülfit redükte eden bakteriler, membran filtrasyon yöntemi ile analiz edilir, çünkü bu analizlerde analiz edilen su miktarı 50-250 mL arasında değişmektedir ve bu miktardaki numune analizleri için pratik olarak membran filtrasyon yöntemi, en akılcı analiz yöntemidir.
Membran filtrasyon yöntemi ile ilgili olarak bu sitenin ana sayfasında görülen ve bilgisayarlara şifresiz ve ücretsiz olarak indirilebilen “Gıda Mikrobiyolojisi 2019” kitabının 08.03. Membran Filtrasyonbölümünde ayrıntılı olarak verilmiştir.
04. Sularda Özel Mikrobiyolojik Analizler
Amaca uygun olarak sularda farklı mikroorganizmaların analizi yapılabilir. Bu bölümde farklı mikroorganizma grupları için analiz örnekleri verilmiştir.
Sularda koliform grup/ E. coli var/yok analizi
LMX broth 100 mL su için yetecek miktarda tartılıp blister ambalaja doldurulmuş ve ışınlanarak sterilize edilmiştir (ReadyCult Coliforms). Analiz edilecek olan su numunesinden steril bir kaba 100 mL alınır, bir ambalaj içeriği bu suya katılır, karıştırılarak 35-37 oC’ta 24 saat inkübasyona bırakılır. Başlangıçta açık sarı rengin, yeşile dönmesi koliform grup bakteri varlığını gösterir. Koliform grup bakteri yükü fazla ise renk dönüşümü daha erken olur. Koliform grup pozitif sonuç alındığında 366 nm uzun dalga boylu UV lamba ile kontrol edilir. Floresan ışıma, E. coli varlığını gösterir. Bu ürünün 50 mL su numunesi için olan ambalajı da vardır.
Sularda enterokok var/yok analizi
Chromocult Enterococci broth 100 mL su için yetecek miktarda tartılıp blister ambalaja doldurulmuş ve ışınlanarak sterilize edilmiştir (ReadyCult Enterococci). Analiz edilecek olan su numunesinden steril bir kaba 100 mL alınır, bir ambalaj içeriği bu suya katılır, karıştırılarak 35-37 oC’ta 24 saat inkübasyona bırakılır. Başlangıçta açık sarı rengin, mavi yeşile dönmesi enterokok varlığını gösterir. Enterokok yükü fazla ise renk dönüşümü daha erken olur.
Yüksek hacimli su numunesinde Salmonella var/yok analizi
Örneğin 1000 mL su numunesi standart yöntemle membran filtreden geçirilir. Filtre doğrudan Salmonella için selektif bir katı besiyerine aktarılıp inkübasyona bırakılabilir. Bu koşulda analiz edilen su numunesinde aktif Salmonella varsa selektif katı besiyerinde gelişerek koloni oluşturabilir. Ancak Salmonella hasar görmüş ise selektif katı besiyerinde koloni oluşturamaz ve sahte negatif sonuç alınır. Bu durumda filtrenin 40-50 mL kadar Tamponlanmış Peptonlu Su içine bırakılıp standart analiz ile devam edilmesi doğru olacaktır. Patojenlerin analizi bu sitenin ana sayfasında görülen ve bilgisayarlara şifresiz ve ücretsiz olarak indirilebilen “Gıda Mikrobiyolojisi 2019” kitabının 07.02. Klasik Yöntemlerbölümünde ayrıntılı olarak verilmiştir.
Bu uygulama diğer patojenler için de geçerlidir.
05. Seyreltme ve Taşıma Suyu
Membran filtrasyon yöntemi, çok düşük hatta sıfır sayıda mikroorganizma analizine uygundur. Sadece toplam bakteri için belirli düşük sayıda koloniye izin verilir. Dökme yöntemi ile standart 9 cm çaplı Petri kutusunda 100 koloni rahatlıkla sayılabilir, ancak standart çapta membran filtrelerde en çok 25 koloni rahatlıkla sayılabilir.
Her ne kadar adı geçen yönetmelikte toplam koloni sayımının dökme yöntemi ile yapılması önerilmekle beraber kimi laboratuvarlarda otoklav bulunmaması vb. nedenlerle toplam koloni sayımı da membran filtrasyon yöntemi ile yapılmaktadır. Bu gibi laboratuvarlarda 1 mL su numunesi doğrudan membran filtrasyon sisteminden geçirilebileceği gibi 0,1 ya da 0,2 mL su numunesi de bu amaçla kullanılabilir. Bu uygulama da bir anlamda seyreltmedir.
Membran filtrasyonda 0,1; 0,2; 1 ve hatta 2-3 mL gibi düşük hacimlerde sıvı filtre edilecekse bu düşük hacimler filtre yüzeyine düzgün dağılamayacağı için sağlıklı bir sayım sonucu alınamaz. Bu gibi uygulamalarda filtrasyon hunisine önce 40-50 mL steril damıtık su aktarılır ve filtre edilecek numune bunun üzerine eklenir.
Bu amaçla kullanılacak 40-50 mL steril damıtık su, “taşıma suyu” olarak adlandırılır ve hacmi önemli değildir çünkü bu su sterildir.
06. Kullanılmış Malzemenin Sterilizasyonu
Analiz sonunda membran filtre üzerinde hiçbir koloni gelişmemiş olsa bile prensip olarak analizde kullanılmış olan tüm malzeme tercihen özel otoklav torbası içinde otoklavda 121 oC’ta 15 dk süre ile otoklavlanmalıdır.
Otoklav bulunmaya laboratuvarlar için kimyasal sterilizasyon uygulanır. Bu amaçla en pratik yöntem marketlerden çok ucuz fiyatlarla sağlanabilecek standart çamaşır suyu kullanılmasıdır.
Bilinen ve güvenilir bir marka ürünü çamaşır suyu uygun bir kapta %1 derişimde hazırlanır, kullanılmış tüm malzeme bu çözeltide tam ıslanmış olmak kaydı ile bir gece bekletilir, ertesi sabah uygun bir şekilde imha edilir/ çöpe atılır.
%1 derişimdeki çamaşır suyu laboratuvar dışında işletmelerde hela tabanlarının ve kapı kollarının dezenfeksiyonu vb. amaçlarla da kullanılabilir.