Tek Hücre Proteini

Tek Hücre Proteini

01. Genel Bilgiler

02. THP Üretiminde Kullanılan Substratlar

03. Algler ile THP Üretimi

04. Bakteriler ile THP Üretimi

05. Mayalar ile THP Üretimi

06. Küfler ile THP Üretimi

07. Candida utilis

01. Genel Bilgiler

Tek hücre proteini (THP; Single Cell Protein: SCP) deyimi insan ve hayvan beslenmesinde kullanılmak üzere endüstriyel boyutta üretilmiş olan mikroorganizmaların kurutulmuş biçimleri için kullanılmaktadır.

Beslenmede mikroorganizmalardan yararlanma olgusu tarihin çok eski zamanlarına kadar uzanır. Şarap, yoğurt, ekmek ve birçok fermente gıdanın hazırlanışı insanoğlunun ilk keşfettiği hazırlanmış gıdalar arasındadır. Bunun yanında alkali su birikintilerinde doğal olarak yetişen mikroalglerin Aztekler tarafından tüketildiği de bilinmektedir.

Giderek artan dünya nüfusunun beslenme sorununun temeli protein yetersizliğidir. İnsanların günlük protein gereksinmeleri 20 gramı zengin (esansiyel) aminoasitlerden oluşmak kaydıyla günde 70 gramdır. Dünya yüzeyinde üretilen proteinin 2/3'ü gelişmiş ülkelerde kalanı ise gelişmekte olan ülkelerde tüketilmektedir.

Bu durumda azgelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde günlük protein tüketimi 12 g kadardır. 2000 yılında dünya nüfusunun tümünün protein gereksinimini karşılamak için 10 yıl öncesine göre üretimin tahıllarda %10, baklagillerde %225 ve hayvansal ürünlerde %210 düzeyinde artırılmış olması gerekir.

Bu durumda insanların yeterli ve dengeli beslenmesi için 3 çözüm yolu vardır. Bunlar; nüfus artış hızının durdurulması, alışılmış gıdaların üretiminin artırılması ve alışılmamış gıdaların üretiminin artırılması şeklinde özetlenebilir. İlk iki çözüm yoluna göre yeni gıda kaynaklarının bulunması, THP üretimi dikkate alındığında ucuz, çabuk ve kolay bir yöntem olarak ortaya çıkmaktadır.

Mikroorganizmaların doğrudan beslenme amacıyla kullanılmaları ilk kez 19. Yüzyıl sonlarında bira atık mayasının hayvan yemine katılması ile başlamıştır. Protein kaynağı olarak insan ve hayvan beslenmesinde tek hücre proteini kullanılması ise ilk kez Almanya'da 1910 yılında araştırılmaya başlanmış ve 1. Dünya Savaşında melastan Saccharomyces cerevisiae mayası üretimi için endüstriyel tesisler kurulmuştur. Daha sonra yine Almanya'da 1930'lu yıllarda yapılan çalışmalarda odun atıkları hidrolizatından ve kâğıt fabrikası atığı sülfit suyundan maya üretimi üzerinde durulmuş ve Candida utilis‘in kullanılması ile üstün nitelikli gıda ve yem mayası üretilebileceği ortaya konulmuştur.

1950'li yıllarda açlık tehlikesinin ciddi boyutlara ulaşacağı fark edilmiş ve THP üretimi üzerindeki çalışmalar yoğunlaştırılmıştır. Bu çalışmalar iki temel gruba ayrılabilir:

- Besin değerini yükselterek fermente gıdaların tüketimini artırmak,

- Endüstriyel artıkları substrat olarak kullanarak mikrobiyel biyomas (biyokütle) elde edilmesi, bunun insan veya hayvan beslemesinde, tarım topraklarının ıslahında kullanılarak değerlendirilmesi ve dolaylı olarak çevre kirliliğinin önlenmesine katkıda bulunmak.

Mikroorganizmaların oluşturduğu proteinin hayvansal proteinle kıyaslanmasında birçok farklılık dikkate çarpar. Öncelikle mikrobiyel protein üretimi çok hızlıdır. 500 kg ağırlığında bir sığır günde 0,5 kg protein üretebilirken aynı miktarda 500 kg mayanın bir günde ürettiği protein miktarı 100.000 misli fazlası ile 50 tondur. Mikrobiyel biyomas üretiminin bir diğer üstünlüğü tarımsal üretimde olduğu gibi geniş alanlara ve elverişli iklim koşullarının sağlanmasının zorunlu olmamasıdır. Tarımsal ve endüstriyel artıkları ve yan ürünleri hammadde olarak kullandığı için üretim maliyeti düşüktür, çevre kirliliğini kaldırıcı etki yapar. Endüstriyel önemi olan mayalardan elde edilen biyokütlenin aminoasit içeriği yönünden incelenmesinde, kükürtlü aminoasitler dışında diğer aminoasitlerin FAO örnek proteini düzeyinde, hatta bazılarının bundan daha yüksek düzeyde olduğu görülür. THP, methiyonin aminoasidi ile desteklendiğinde dengeli bir aminoasit kompozisyonuna ulaşır ve yararlanılabilir protein oranı (NPU) kazeininkine eşdeğer olur. THP'lerinin lisin ve triptofan içerikleri de yüksektir. Bu yönden tahıllara destekleyici olarak ilave edilirler. THP'leri kükürtlü aminoasitler bakımından balık unundan daha düşük düzeydedir. Ancak soya unu ile aynı düzeyde aminoasit içerir.

THP'nin doğrudan insan beslenmesinde kullanılmasını kısıtlayan 3 faktör vardır.

- THP'leri yüksek düzeyde nükleikasit içerirler. Günlük protein alımı içinde nükleikasit miktarı fazla olursa böbrek taşı oluşumu ve gut hastalığı görülebilir.

- Hazmolmaları düşüktür, gastrointestinal (mide-bağırsak) sistemde olumsuzluklar yaratabilir. Aynı şekilde deri hastalıkları da meydana gelebilir.

- Kullanılabilen substrattan (hammaddeden), biyosentezden veya işlem ya da kurutma sırasında karsinojen (kansere neden olan, kanserojen) veya toksik maddeler gelebilir.

Yapılan çalışmalar, kurumadde üzerinden nükleikasit miktarlarının alg THP'lerinde %4-6; bakteri THP'lerinde %16'ya kadar; mayalarda %6-11; küf THP'lerinde %2,5-6 düzeyinde olduğunu göstermiştir. Günlük 2 gram nükleikasit alımının güvenlik sınırları içinde olduğu belirtilirken 3 gram/gün nükleikasit tüketiminde böbrek taşı ve gut oluşumu için ciddi tehlike vardır. Geviş getiren hayvanlar ve kümes hayvanları nükleikasitlere insanlara oranla daha dayanıklıdır.

Hidrokarbonlu substratlar üzerinde üretilmiş maya THP'lerinde iz haldeki n-alkanların, tek karbonlu yağ asitleri ya da polisiklik hidrokarbonların kalıntılarının varlığı halindeki olası zararlar üzerinde durulmaktadır. Hidrokarbon substratı üzerinde üretilmiş Candida THP'lerindeki polisiklik hidrokarbon miktarının diğer ticari maya ürünlerinden ve benzer gıdalardakilerden daha yüksek olmadığı ortaya konulmuştur.

Bu tip tehlikeler karşısında THP 'lerinin genel olarak hayvan yem rasyonlarına ilave edilmesi, böylelikle insan beslenmesinde dolaylı olarak kullanılması eğilimi vardır. Bununla beraber biyoteknolojideki gelişmeler ile tüm olumsuz maddelerden arındırılmış THP'lerinin üretilebileceği ortaya koyulmuştur.

02. THP Üretiminde Kullanılan Substratlar

THP üretiminde substrat olarak çok sayıda artık veya yan ürün kullanılabilir. Bunlar arasında Türkiye açısından en önemli olanlar tarım ve tarıma dayalı sanayi artıklarıdır. Meyve sebze işleme sanayii artıkları (posa, kabuk vs.), vinas (kuru üzüm ve incirden alkol edilirken geriye kalan sıvı), melas (şeker sanayii artığı), peynir altı suyu, keçi boynuzu, tahıl hasadından geriye kalan sap saman, bira sanayii ve nişastalı ürünler sanayiinin artıkları ve zeytin kara suyu (zeytinlerin yağı alındıktan sonra kalan artığı) bu konuda ilk akla gelen substratlar arasındadır.

03. Algler ile THP Üretimi

Algler, yapay ışık ve güneş ışığını kullanarak fotosentetik ve ototrofik olarak, karanlıkta ise organik karbonları kullanarak heterotrof olarak gelişebilirler. Alglerle ilgili çalışmaların büyük bölümü güneş ışığını kullanarak fotosentetik koşullarda atık suyun oksidasyonla temizlenmesi üzerinde yapılmıştır.

THP üretiminde en önemli alg türleri Chlorella sorokiniana, Scenedesmus aucutus,                        S. quadricanda, S. abliguus, Spirulina maxima ve Spirulina platensis'dir. Chlorella regularis hem ototrof hem de heterotrofik koşullarda gelişebilir.

Besin kaynağı olarak algler, fotosentez yetenekleri, yüksek protein içerikleri ve basit besiyerlerinde süratle çoğalabilmeleri nedeniyle kullanılmaktadır. THP üretiminde en çok denenen, günümüzde insan ve hayvan beslenmesinde geniş uygulama alanı bulan algler, diğer mikroorganizmalardan farklı olarak yeterli miktarda CO₂, belirli derecede aydınlatma ve geniş üretim alanlarına gerek duyarlar.

Açık sirkülasyon sistemlerinde özellikle atıkların oksidasyonunda tek türe göre karışık kültürlerin kullanımı daha yaygındır.

Alg gelişimini kısıtlayan faktör aydınlanmadır. Gece-gündüz süresi, güneşli gün sayısı gibi etkenler alglerin endüstriyel kullanımım 35° güney ve kuzey enlemleri arasında kısıtlamıştır. Yapılan araştırmalar THP üretimi açısından yapay ışıklandırmanın ekonomik olmadığını ortaya koymuştur.

Havada bulunan %0,03 düzeyindeki CO₂, alg gelişimi için yeterli değildir. Dolayısıyla alg Üretiminde dışarıdan CO₂ verilmesi gerekir. CO₂, fotosentetik-ototrofik alg gelişiminde C kaynağı olarak kullanılır. Alkali göllerde doğal sodyum karbonat miktarı yüksek otduğundan buralarda algler rahatlıkla gelişir. Atık-lağım temizleme sistemlerinde bakteriler tarafından çıkarılan yüksek miktardaki CO₂ ise alg gelişimini sınırlar. Alg gelişimi için CO₂ 'in yavaş, düzenli ve uniform şeklinde verilmesi gerekir.

Amonyum tuzları veya nitratlar halindeki azot kaynağı alg gelişimi için önemlidir. Fosfatlar ve mineral maddeler ile birlikte azot kaynağı lağım suyunda yeterli ölçüde bulunur.

Endüstriyel alg üretimlerinde aseptik koşullara uyulmaz. Bununla beraber lağım sularının alglerle oksidatif arıtım havuzlarında enteropatojen bakterilere ve virüslere dikkat edilmesi gerekir. Chlorella kültürleri suya suda eriyebilen maddeler salgılarlar, bunlar ise bakteriyel gelişmeyi teşvik eder.

Geniş ölçekli alg üretiminde hücreleri süspansiyon halinde tutacak ve çökmeyecek şekilde çalkalamaya ve maksimum hücre verimini sağlayacak şekilde lağım suyu akım hızının ayarlanması dikkate alınması gereken faktörler arasındadır.

Uygun koşulların sağlanması ile Spirulina maxima ve Scenedesmus quadricauda ile lağım suyu kültürlerinde 12-15 gram/m²/gün (kuru ağırlık üzerinden) verim alınabilir.

Alg kültürlerinin üreme ortamından ayrılması (hasadı) önemli bir sorundur. Hücreler, konsantre etme, suyundan süzme ve kurutma ile elde edilir. Alüminyum sülfat, kalsiyum hidroksit ve katyonik polimerler gibi flokülantlar (topaklaştırıcı) ilavesi ile hücrelerin hasadı mümkündür ancak bu flokülantlar alg kültüründen arındırılamaz. Bu durum ise flokülant kullanımı ile hasat edilmiş alglerin yem veya insan gıdası olarak tüketimini engeller. pH 9,5 ya da daha yukarı pH ‘larda algler sığ havuzlarda kendiliklerinden topaklaşırlar.

pH 2,8-3,5 ‘da iyon değiştirici reçine kullanarak algler iyi bir şekilde ayrılabilir. Bununla beraber asit giderleri dikkate alındığında bu yöntemin ekonomik olmadığı ortaya çıkar. Alglerin kendiliğinden topaklaşma ve/veya santrifüjlenerek ortamdan ayrılması bugün için en uygun yöntemlerdir.

04. Bakteriler ile THP Üretimi

Mayalarda 2-3 saat, pek çok alg ve küfte 16 saat olan generasyon süresinin 20-30 dakika olması ile bakteriler önemli bir üstünlük sağlarlar. Pek çok bakteri karbon ve enerji kaynağı olarak çok sayıda substratı kullanırlar. Bu substratlar tarımsal artıklardan, hidrokarbonlar ve petrokimya ürünlerine kadar çok geniş bir dağılım gösterir. Bazı aktinomisetler de bakteriler gibi gelişme gösterir ve THP üretiminde kullanılabilirler.

Bakteri türlerinin pek çoğu, THP üretiminde denenmiştir. THP üretimine uygunluk için yapılan seçimlerde gelişme hızı, verim (protein üretimi), pH ve sıcaklık toleransı, hava gereksinimi, genetik stabilite, fajlardan etkilenmeme gibi özellikler dikkate alınır. Aynı zamanda seçilmiş suşlar bitki, hayvan ve insanlara doğrudan patojen veya oluşturdukları zehirlerle zararlı etki yapmamalıdır.

Substrat ve azot konsantrasyonu bakterinin gelişmesini etkileyen önemli faktörlerdir. C:N oranı 10:1 veya biraz daha düşük olduğunda hücre içinde yüksek miktarda protein birikimi sağlanır ve yağ ile poli-beta-hidroksibütirat gibi depo maddelerinin birikmesi önlenir. Bakteri ve aktinomisetlerin THP üretimi için amonyum tuzları uygundur. Bakteriler fosfora da gerek duyarlar. Ham fosforik asit içinde arsenik ve flor vardır, bu fosforik asit substrata ilave edilirse arsenik ve flor bakteri hücresinde toplanır. Dolayısıyla substrata ilave edilecek fosforik asit en azından hayvan yemi kalitesinde olmalıdır. Genel olarak su kaynakları bakteriyel gelişme için yeterli mineral tuzları içerirler. Bununla beraber bazı sulara demir, magnezyum, manganez gibi tuzların ilavesi gerekir. Çoğu durumda mineraller sülfat veya hidroksit formunda verilir. Klorür halinde verilirse paslanmaz çelik materyal üzerinde korozyon görülebilir.

Gelişme sırasında pH amonyum-fosforik asit ilavesi ile çoğu bakterinin istediği şekilde 5-7 arasında tutulur. Hidrokarbonlardan ve alkollerden bakteriler ile THP üretilirken sıcaklık toleransı önemlidir. Örneğin metandan bakteriyel THP üretiminde ısı açığa çıkar. Eğer bakteri sıcaklığa duyarlı ise soğutma işlemi gerekir. Bu ise üretim maliyetini yükseltir.

Sterilitenin sağlanması bakteriyel THP üretiminde önemlidir. pH 5-7 arasında tutulan gelişme ortamında gelişmesi istenen suşlar yanında enteropatojen suşlar da iyi bir şekilde gelişir. Aminoasitler gibi metabolik artıklar kontaminantların gelişmesini teşvik eder.

Uygun gelişme koşulları sağlandığında bakterilerde kuru ağırlık üzerinden %70 protein verimi elde edilebilir (E. coli %70, Lactobacillus fermentans %87, Alcaligenes viscosus %84). Bazı bakteriler birçok mikroorganizmaların aksine kükürtlü aminoasitleri de içerir. Örneğin Mycobacteriumtuberculosis‘te mayalardakinin 10 misli fazla metiyonin vardır. Ancak patojen türlerin THP üretiminde kullanılması söz konusu olamaz.

Bakteriyel THP üretimi için petrol ürünleri, doymuş hidrokarbonlar, metil alkol ve metan substrat olarak denenmektedir. Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Microbacter, Brevibacteriumve Pseudomonas türleri üzerinde THP üretimi için ağırlıklı olarak çalışılmaktadır. Pseudomonas türleri kullanılarak elde edilen THP 'leri genellikle tatsız ve kokusuzdur. Yapılarında temel aminoasitlerin hemen hepsi vardır.

Hidrokarbonlar substrat olarak kullanıldığında bakteri ve aktinomisetler 1 gram substrata karşı 0,80-1,20 gram kuru madde oluştururlar. Metil alkol için bu değer 0,48-0,50 gram, kompleks karbohidratlar için 0,51-1,35-gramdır. Metanın patlayıcı olabilmesi nedeniyle substrat olarak kullanımında özel sistemlere gerek duyulur. Bu sistemler ise THP üretiminde ekonomik olmamaktadır.

THP üretimi amacıyla çoğalmış olan bakterilerin ortamdan ayrılmasında birtakım güçlükler vardır. Pek çok THP üretiminde bakteriyel verim 10-20 gram kuru ağırlık/litre düzeyindedir. Bu durumda çok miktarda sıvı ile çalışılması gerekir. Bakteri hücrelerinin özgül ağırlıklarının suya çok yakın olması da santrifüj ile ayrımın maliyetini çok yükseltmektedir.

05. Mayalar ile THP Üretimi

Yüksek protein içerikleri bakımından mayalar yalnız hayvanlar için değil insanlar içinde besin kaynağıdır. 2. Dünya Savaşı sırasında Almanya ve SSCB'de insan besini olarak mayadan elde edilen THP kullanılmıştır.

Mayaların üretiminde melas, patates nişastası, şeker, peyniraltı suyu, meyveler, sülfit sıvısı, bira ve kâğıt endüstrisi artıkları, hidrokarbonlar ve petrol ürünleri substrat olarak kullanılabilir. Saccharomyces cerevisiae, S. fragilis, S. pasterianus, Torulopsis utilis, Brettanomyces türleri, Candida tropicalis, C. utilis, C. lipolytica, C. maltosa, C. intermedia üzerinde en çok durulan türlerdir. Torula mayalarının içerdiği protein miktarı süttozu proteininden 2 kat fazladır.

Mayaların değişik gelişme faktörlerine gerek duymaları uygun substrat seçiminde önemlidir. S. cerevisiae aminoasitlere ve tiyamin, niasin, pridoksin, pantotenik asit, inositol gibi B vitaminlerine gerek duyar ve bunların bol bulunduğu şeker pancarı ve şeker kamışı melasında iyi bir gelişme gösterir.

Candida utilis ise pentozları kullanabilen, aminoasit ve gelişme faktörü olarak B vitaminlerine gerek duymayan, amonyum tuzlarını azot kaynağı olarak kullanabilen bir türdür.

THP üretiminde bakteriler için verilen gelişme hızı, verim, pH ve sıcaklık toleransı, genetik stabilite, havalandırma ihtiyacı, patojen olmama gibi tüm tür ve suş seçimi kriterleri maya seçiminde de geçerlidir.

C:N oranı 7:1 ile 10:1 arasında olduğunda iyi bir protein verimi elde edilir. Karbohidratların miktarı kesikli kültürlerde %1-5 arasında, sürekli kültürlerde daha düşük olmalıdır. Yüksek C:N oranlarında özellikle Rhodotorula mayaları önemli miktarda yağ depolarlar.

Susuz amonyak ve fosforik asit pH kontrolünde kullanılabilir. Bakteriyel kontaminasyon riskini en aza indirmek amacıyla pH 3,5-4,5 arasında iyi bir gelişme gösteren mayaların seçimi gerekir.

Bakterilerde olduğu gibi mayalar da karbohidratlar, hidrokarbonlar veya alkolde gelişirken ısı açığa çıkarırlar. Örneğin C. utilis, karbohidrat yerine geçen atık sülfit likörünü kullanırken yaklaşık 3740-8000 kcal/kg kuru ağırlık düzeyinde ısı üretir. Pek çok mayanın en yüksek gelişme sıcaklığı 30-34 °C 'dır. THP üretilen yerlerde 20 °C altındaki soğutma suyu doğal kaynaklardan sağlanabilmelidir.

Aerobik koşullarda maya gelişmesi için oksijene gerek vardır. Karbohidrat kullanılarak yapılan üretimlerde 1 gram kuru hücre ağırlığı için 1 gram oksijene gerek vardır, n-alkenler ile yapılan üretimde ise bu değer 2 gram oksijendir.

Mayadan THP üretimi steril veya steril olmayan koşullarda yapılabilir. Üretim teknolojisi, cinsi, maliyet unsurları ve en önemlisi hammadde, steril veya steril olmayan üretim koşullarının seçiminde rol oynar. C. utilis kullanarak sülfit atık suyundan THP üretiminde, ortam önce sterilize edilir, sonra temiz fermentörlere alınır. Bununla beraber üretimde steril koşullar devam ettirilmez. Kontaminasyon kontrolü pH 'nın 6 'nın altında tutulması, havanın sterilize edilerek verilmesi ve ortamda sürekli yüksek sayıda maya hücresi bulundurulması ile yapılır.

Mayalarla THP üretiminde endüstriyel boyutta en çok kullanılan tür, Candida utilis'dir. ABD'de sülfit atık suyu, etil alkol, Çekoslovakya'da etil alkol kullanarak THP üreten büyük kapasiteli tesisler bulunmaktadır. Türkiye'de melastan kanatlı yemi için THP üretimi için çalışmalar yapılmıştır.

Maya hücrelerinin 5-8 μm çapında ve yoğunluklarının 0,09-1,04 g/cm³ olmaları sürekli santrifüj yöntemiyle üretim ortamından kolaylıkla ayrılmalarını sağlar. Genellikle ilk santrifüjden sonra maya kitlesi yıkanıp tekrar santrifüjlenir. Bazı teknolojilerde 2. bir yıkama-santrifüj işlemi de uygulanabilir. Bu şekilde elde edilen biyokitlede %15-20 kurumadde vardır.

n-alkenlerden Candida türleri kullanılarak THP üretiminde ilk santrifüjden önce iz haldeki hidrokarbonların arındırılması için surfaktant ile yıkanması gerekir.

Peyniraltı suyunda üretilen Kluyveromyces fragilis 'in ayrılması için ortam 3 kademeli evaporasyon işleminden geçirilerek kurumadde %8'den %27'ye çıkarılır. Bu haliyle insan gıdası olarak kullanılabilir. Daha yüksek konsantrasyonda protein ve düşük konsantrasyonda kül içeren ürün elde edilmek istenirse çok kademeli santrifüjleme işlemi kullanılır.

Üretme ortamından hasat edilen hücreler tamburlu veya püskürtmeli kurutuculardan geçirilerek kurutulabilir. Tamburlu kurutucularda ısı etkisiyle ölüm sonucu maya hücreleri sayısı 100-100.000 (2-5 logaritma birimi) kez azalır. Ortamda bulunabilecek bakterilerin de sayısı aynı düzeyde azalır. Tamburlu kurutucularda sıcaklık kolaylıkla kontrol edilemez. Dolayısıyla üründe yanmanın meydana getireceği kararmalar olabilir.

Püskürtmeli kurutucularda maya hücrelerinde ölüm oranı 100.000-100.000.000 (5-8 logaritma birimi) kadardır. Ortamda bulunabilecek bakteriler de (Salmonella, Staphylococcus) aynı oranda ölürler. Püskürtmeli kurutucudan geçirilerek elde edilen ürün, tamburlu kurutucudan elde edilene göre daha kalitelidir.

06. Küfler ile THP Üretimi

B grubu vitaminler açısından oldukça zengin, protein oranları %30-60 arasında değişen küflerin düşük nükleik asit içermeleri, bunlardan elde edilen biyokitlelerin misel yapısı sayesinde üretme ortamından çok rahatlıkla ayrılması, THP'nın tat gibi fiziksel özelliklerinin daha kolay kabul edilmesi gibi nedenlerle son zamanlarda küflerden THP üretimi üzerinde yoğun çalışmalar yapılmıştır. Buna karşılık üretme şartlarının zorluğu, generasyon süresinin uzun olması (6-16 saat veya daha fazla) küflerden THP üretiminde önde gelen sorunlar arasındadır. Kuşkusuz küf THP'lerinin üretimini kısıtlayan en önemli faktör küflerin oluşturduğu toksik ve karsinojen maddelerdir. Ancak bu tip bileşikleri oluşturmayan türlerin ve suşların THP üretiminde kullanılması söz konusu olabilir.

Kullanılan substrat toksik-karsinojen bileşiklerin oluşumunda etkili olabilmektedir. Küfler bugün daha çok çeşitli gıdaların tat ve kokularını geliştirmek için kullanılmaktadır. Uzakdoğu’da üretilen pek çok gıda ve küflü peynir (rokfor ve kamambert) bunlara en tipik örneklerdir.

THP üretimi amacıyla kullanılan küfler Aspergillus ve Trichoderma türleridir. Bunların yanında pek çok küf türü ile de çalışılmaktadır.

Yenilebilir şapkalı mantarların miselleri de çeşitli substratlar üzerinde THP elde edilmesi amacıyla üretilebilir.

07. Candida utilis

C. utilis maya fabrikalarından bir kontaminant olarak izole edilmiştir. Yukarıda da belirtildiği gibi 2. Dünya Savaşı sırasında Almanya'da pentoz içeren odun hidrolizatından yem ve insan gıdası üretimi için kullanılmıştır. Gelişme faktörlerine (B vitaminleri) ve aminoasitlere ihtiyaç duymaması, amonyum tuzlarının azot kaynağı olarak kullanabilmesi gibi avantajları sayesinde savaş sonrasından günümüze kadar üzerinde çok çeşitli araştırmalar yapılmıştır.

Candida utilis‘ten THP üretimi için en çok kullanılan substratlar etil alkol, sülfit atık suyu, anaerobik atık su arıtma sistemlerinden arta kalan yarı temizlenmiş atık su, melas, tapioca nişastası ve Endomycopsis fibuligera ile birlikte simbiyotik olarak kullandığı patates nişastası atıklarıdır. Endomycopsis fibuligera amilaz üreterek nişastayı başta glikoz ve maltoz olmak üzere mono ve di sakkaritlere parçalar, C. utilis ise bu şekerleri kullanır. İsveç Şeker Endüstrisi tarafından geliştirilen ve başlangıçta patates işleme atıkları için dizayn edilen yöntem pirinç işleme atıkları gibi nişasta içeren diğer subtratlara da uygulanabilmektedir.

Günde 40-100 kg kuru C. utilis mayası üretmek için kurulan ve 126 m³/saat kapasiteyle biyolojik oksijen gereksinimi (Biological Oxygen Demand; BOD) değeri 15.000 olan atık su kullanan tesiste, işlem sonrası atılan atık sudaki BOD değeri %80 veya daha fazla azalabilmektedir.

C. utilis’in sülfit liköründe THP elde edilmesi amacıyla yapılan üretimde pH 5, sıcaklık 32 °C olduğunda kurumadde üzerinden substratın 1 gramından 0,35 gram ürün elde edilebilmektedir. 100 gram kuru ağırlıktaki maya kitlesinin bileşimi ise 9 gram azot, 55 gram protein, 5 gram yağ, 8 gram kül şeklindedir. Aminoasitlerin bileşimi ise gram/16 gram N değeri ile alanin 5,8; arjinin 5,4; asparagin 9,2; cystein; glutamik asit 15,6; glisin 3,6; histidin 1,2; isoleusin: 3,8; leusin 7,6; lisin 4,8; methiyonin 1,1; fenil alanin 8,6; prolin 6,0; serin 5,0; threonin 5,4; triptofan 2,4; tirosin 6,2; valin 3,8'dir.

Mayaların THP üretiminde kullanılmalarının diğer mikroorganizmalara göre bazı üstünlükleri vardır.

- Besin olarak kolay kabul edilirler. Bu özellikleri tat ve kokularının alışılmış gıdalara benzemesi veya yakın olmasından kaynaklanır,

- Genetik yapıları stabildir,

- Düşük pH'larda üretilmeleri bakteriyel kontaminasyon riskini azaltır,

- Hücre boylarının büyük, özgül ağırlıklarının fazla olması nedeniyle üretim ortamlarından santrifüjle kolay ayrılabilirler,

- Nükleikasit miktarları düşüktür (mayalarda %8-10; bakterilerde %18-20)

- Gelişme hızları yüksektir,

- Çeşitli substratlarda gelişebilirler,              

- Amonyum tuzlarını azot kaynağı olarak kullanabilirler,

- Protein içerikleri yüksektir,

- Kükürtlü aminoasitler dışında aminoasit profilleri dengelidir.

Bu üstünlükleri nedeniyle mayalardan elde edilen THP uzun bir süreden beri kullanılmaktadır. Özellikle C. utilis'in pek çok substratı yüksek verim ile kullanabilmektedir.

Türkiye'de şeker fabrikasyonu artıklarından olan melastan C. utilis kullanarak yem mayası üretimi üzerinde çalışılmıştır.

Melas,

-Diğer şekerli hammaddelere oranla çok ucuzdur,

- Bünyesinde şeker dışında mineral maddeler, organik bileşikler, vitaminler gibi mikrobiyel faaliyet için gerekli olan bileşikler bulunur,

- Ekmek mayası, besin mayası ve yem mayası üretiminde en çok kullanılan substrattır,

- Fermantasyon sanayiinde geniş kullanım alanı vardır,

- Tarımsal atıklara oranla kurumadde oranının yüksek olması (%80) nakliyede avantaj sağlar,

- Mevsimlere bağlı olmaksızın her zaman sağlanabilir,

Melasın bileşimi ve fiziksel özellikleri şeker pancarının yetiştirilme şartlarına ve şeker fabrikasyonuna bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Ancak, sitrik asit ve ekmek mayası üretimlerinde olduğu gibi THP üretiminde de bu değişiklikler kayda değer etki yapmaz.

Melasın kimyasal bileşiminde %20-54 arasında bulunan karbohidratlar en önemli gruptur. Karbohidratların çoğunu sakkaroz oluşturur. Diğerleri ise glikoz, früktoz, rafinoz gibi fermente olabilen şekerlerdir. Melas içinde bulunan azotlu maddeler; protein, aminoasitler, amidler, betain, amonyum tuzları ve nitratlardır. Nitritler bazı melaslarda bulunabilir. Mayalar melastaki azotun ancak %0,02-0,9'luk kısmım kullanılır. Melasta %2 kadar azotlu maddeler olduğu dikkate alınırsa toplam azotlu madde miktarı bakımından yeterlilik görülmektedir. Kuşkusuz bu azotlu maddelerin profili önemlidir.

C. utilis kullanılarak melastan yem mayası olarak THP elde edilmesinde üretim parametreleri aşağıdaki gibi özetlenebilir.

Melas Konsantrasyonu: Biyomas veriminde melas konsantrasyonu önemlidir. Substrat içinde melas konsantrasyonu arttıkça biyomas verimi düşer. %7'den yüksek konsantrasyonlarda maya besin maddelerinin tümünü kullanamaz, ayrıca ozmotik basınç ve ağır metallerin inhibe edici etkisi bu biyomas veriminin düşüklüğüne neden olur. %3-7 melas konsantrasyonu en yüksek verimin alındığı değerdir. Melas konsantrasyonu arttıkça toplam biyomas miktarı artar, ancak elde edilen biyokütlenin, kullanılan melasa oranı demek olan verim düşer, bir miktar melas kullanılmadan kalır. Çevre kirliliği, işletme ekonomisi gibi hususlar dikkate alındığında yüksek miktarda biyokütle değil, yüksek verimlilik önemlidir.

İnkübasyon Süresi: Düşük melas konsantrasyonlarında 24 saatte yüksek biyomas verimi elde edilmekte, inkübasyon süresi 48 ve 72 saate çıktığında verimlilik düşmektedir. Bu durum mayaların inkübasyon ilerledikçe kendiliğinden parçalanması ve santrifüjleme sırasında üretme ortamından ayrılamadığı şeklinde açıklanabilir. Melas konsantrasyonu arttıkça bu kez uzun inkübasyon sürelerinde daha fazla biyokütle ve dolayısıyla daha yüksek verimlilik elde edilmektedir. Ancak düşük (%7) melas konsantrasyonunun kullanılması verimlilik açısından gerekli olduğundan buna bağlı olarak 24 saatlik inkübasyon süresi optimumdur.

pH'ın Etkisi : Mayaların çoğu 4-6 pH arasında optimum olarak çoğalırlar. Bu sınırlar arasında kalmak kaydıyla pH kontrolüne gerek yoktur. Bununla beraber başlangıç pH'sının 4 olarak ayarlanması bakteriyel kontaminasyon riskini azaltır.

Azot Kaynağı: Mayalar amonyum iyonlarındaki azotu, aminoasitlerdeki azota oranla daha kolay alırlar. Ancak dengeli bir aminoasit kompozisyonu amonyum iyonlarından daha yarayışlıdır. Üre mayalar tarafından azot kaynağı olarak kullanılabilirse de metabolize edilme hızı düşüktür. Bütün mayalar amonyum sülfat, diamonyum fosfat, triamonyum fosfat, amonyum klorür, amonyum bikarbonat, karbonat, asetat, laktat, tartarat tuzlarını azot kaynağı olarak kullanabilirler. Azot kaynağı ilave edileceğinde maliyet ve verimlilik unsurları beraberce dikkate alınmalıdır. Amonyum sülfat, amonyum klorür, amonyum fosfat benzer verim artışları gösterir. %0,5 (w/v) oranında amonyum sülfat ilavesi ekonomik faktörler de dikkate alındığında en uygun azot kaynağıdır.

Fosfor: Çözülebilir fosfatlar maya tarafından metabolize edilir ve gelişmeleri için mutlaka gereklidir. Mayalar KH₂PO₄ 'ü kolaylıkla kullanır. Bunun yanında amonyum fosfat, süperfosfat, fosforik asit de fosfor kaynağı olarak geliştirme ortamına katılabilir. %0,1 (w/v) oranında KH₂P0₄ veya süperfosfat ilavesi en uygun fosfor kaynağıdır.

Fermentör Seçimi: Laboratuvar veya endüstriyel ölçekli üretimler 3 tiptir. a) Kesikli (Batch:discontinue) sistemde fermentör bir kez doldurulur, işlem bitene kadar açılmaz, besin maddesi ilavesi yapılmaz. Burada ortam koşulları üreme başladığı andan itibaren değişmeye başlar. Mikroorganizma sayısı artarken substrat konsantrasyonu düşer. b) Kesikli beslemeli (Fed-batch) sistemde karbohidratlar gelişme periyodu içinde artan miktarlarda verilir. Böylece şeker konsantrasyonu ve gelişme hızı kontrol altında tutulur. c) Sürekli (continue) yöntemde kültür koşulları ve substrat konsantrasyonu sabit tutularak mikroorganizma sürekli logaritmik gelişme periyodunda tutulur. Kesikli üretim yönteminde en büyük dezavantaj havalandırmanın yetersiz ve/veya şeker konsantrasyonunun yüksek olması halinde anaerob faaliyet sonucu biyokitle üretimi azalmakta buna karşılık etil alkol üretimi artmaktadır. Genel olarak bu durum Saccharomyces türlerinde meydana gelmekte, ancak Candida utilis de belirli koşullarda etil alkol üretilebilmektedir. Sürekli yöntemin dezavantajları ise kontaminasyon riskinin yüksek olması, mikroorganizmanın genetik stabilitesinin yakından kontrol edilememesidir. Sürekli yöntemde üretimin bitişini mikroorganizmada gözlenen mutasyon belirler. Bu gibi dezavantajlar dikkate alındığında beslemeli kesikli yöntem daha uygun olarak görülmektedir. Beslemeli kesikli yöntem, kesikli yönteme oranla %50 kadar yüksek verim sağlar.

C. utilis'ten Elde Edilen Yem Mayasının Değeri: Candida utilis kullanılarak melastan üretilen THP'nin, besin mayası, balık unu, soya küspesi ile kıyaslandığında elde edilen bulgular aşağıdaki şekilde özetlenebilir. Yem mayası, besin mayası ile aynı miktarda nem, protein, kül, ham yağ karbohidrat, riboflavin ve niasin içerir. Tiamin besin mayasında daha yüksektir. Yem mayası protein içeriği bakımından balık unundan daha fakir, ancak soya küspesi ile eşittir. Yağ miktarı soya küspesine göre önemli ölçüde yüksek, balık ununa göre ise C. utilis suşlarına göre değişmek üzere eşit veya düşüktür. Riboflavin, niasin ve tiamin miktarları bakımından yem mayası balık unu ve soya küspesine göre çok yüksektir. Aminoasit profilleri bakımından değerlendirildiğinde yem mayasında sistin ve metiyonin gibi kükürtlü aminoasitleri bakımından balık unu, soya küspesi ve FAO örnek proteinine benzer değerler gösterir. Yem mayası sentetik DL metiyoninle takviye edilebilir. Yem mayasında yağ asitlerinin büyük çoğunluğu doymamış yapıda olup mısır yağına benzerlik gösterir. Esansiyel yağ asitlerinden linoleik asidin miktarı yağ asitleri toplamının yaklaşık yarısıdır. Oleik ve palmitik asit miktarları da yüksektir. Yem mayasında toksik etkisi bilinen yağ asitleri bulunmaz. Yağ asitlerinin kompozisyonu insan ve hayvan beslenmesinde önemlidir. Doymamış yağ asitleri, hayvanlarda yağ asitleri eksikliğine bağlı olarak meydana gelen hastalıkların tedavisinde kullanılır. Hayvan organizmasında sentezlenemeyen yağ asitleri içinde en önemlileri; linolenik, linoleik ve arakidonik asitlerdir. Yem mayasında yukarıda da belirtildiği gibi linoleik asit miktarı yüksektir. Mayaların mineral madde içerikleri de besin değeri açısından önem taşır. Yem mayasında %7-10 kadar kül bulunur. Külün büyük çoğunluğunu potasyum ve fosfor oluşturur. Balık ununda ise kalsiyum ve fosfor bulunur. THP'nde balık ununa yakın değerlerde potasyum, demir ve çinko bulunur. Bu veriler de yem mayasının uygun bir besin olduğunu gösterir.

THP'nın Kanatlı Yemi olarak Değerlendirilmesi: Kanatlı kümes hayvanlarının yem rasyonlarında kesinlikle bulunması gereken hayvansal protein bakımından Türkiye'de sık sık dar boğazla karşılaşılır. Hayvansal proteinli yem maddeleri içinde özellikle balık unu bazı yıllarda miktar bakımından yeterli olabilirse de balığın çeşitli yöntemlerle insan tüketimine sunulması kuşkusuz en akılcı uygulamadır. Bu bakımdan hayvansal protein yerine geçebilecek yem hammaddeleri arasında ilk akla gelen C. utilis'ten melas kullanılarak elde edilen THP'dir. Yem mayasının kimyasal yapısı yukarıda açıklanmıştır. Yetersiz olan tek madde metiyonindir. Yem mayasına sentetik metiyonin ilavesi ile bu sorun kolaylıkla çözülebilir. THP'nin toksikolojik kontrolü fareler üzerinde eleme testi ile yapılır. Bu amaçla sütten yeni kesilmiş 21 günlük beyaz fareler, her grupta 10 dişi 10 erkek olmak üzere gruplara ayrılır. Grupların birisi kontrol olarak ticari fare yemi ile beslenirken diğer gruplar farklı suşlarla ve/veya farklı substratlardan elde edilen THP'lerin protein kaynağı olarak kullanılması ile yapılan yemlerle beslenir. 15 günlük deneme süresi sonunda hayvanların canlı ağırlık artışları, kanda hemoglobin miktarları, karaciğer ve böbrek ağırlıkları, karaciğer ve böbreklerde makroskopik ve histolojik incelemeler yapılır. Kanatlı hayvanlarda yem rasyonu hazırlanmasındaki değerlendirilme ise genellikle sadece canlı ağırlık artışının incelenmesi ile yapılır. Bu amaçla kasaplık civcivler cinsiyet ayrımı yapılmaksızın her grupta 25 adet olacak şekilde gruplara ayrılır. Bir grup ticari broyler yemi ile beslenirken, diğer grup(lar) balık unu yerine protein yönünden eşdeğer miktarda THP katılarak oluşturulan yemle beslenir. Ticari yemin ise uygun preparasyon çerçevesinde laboratuvarda hazırlanması daha doğru bir yaklaşımdır. Ticari karma yem formülünde %7 balık unu bulunur. Buna eşdeğer olan yem mayası protein katım miktarı %9 kadardır. Yine yem eşdeğerliğinin saptanması amacıyla hazırlanan THP katkılı yeme %0,1 oranında ticari DL metiyonin ilavesi gerekir.