Biyoinsektisitler
01. Genel Bilgiler
02. Entomopatojen Mikroorganizmalar
02.01. Bakteriler
02.02. Virüsler
02.03. Küfler
02.04. Protozoonlar
03. Biyolojik İnsektisitlerin Üretimi
04. Bacillus thuringiensis
04.01. Kristal Toksinin Etki Mekanizması
04.02. Preparatlar Üzerine Çevre Faktörlerinin Etkisi
05. Endüstriyel Üretim
05.01. İzolasyon
05.02. Etkili İzolatların Belirlenmesi
05.03. Toz Preparat Hazırlanması
05.04. Ticari Üretim
01. Genel Bilgiler
Tarımsal üretimde hastalık ve zararlılarla mücadele önemli bir uygulamadır. Dünya ortalaması olarak hastalıkların %12, yabancı otların %10 ve zararlıların %14 olmak üzere toplam %36 oranında tarımsal ürün kaybına yol açtığı kabul edilir. Türkiye'de bu oranın %15-20 kadar olduğu tahmin edilmektedir. Bu durumda bitki koruma uzmanlarının görüşü "insanların ürettiklerini değil hastalık ve zararlılardan arta kalanları hasat ettikleri" şeklindedir. Ormanlarda ise böceklerin verdiği zarar, orman yangınlarının verdiği zararın çok üzerinde olup, dünya genelinde yangınların zararının 10 misli fazla olarak kabul edilir.
Bugün dünyada bilinen 1 milyon kadar böcek türünün yaklaşık 15.000 kadarı tarımsal ürünler üzerinde zararlı etki yapar. Bunlardan 300 kadarı ile savaş yapılması gerekir. Türkiye'de 80-100 tür zararlı böcek bulunmaktadır.
Böceklerle yapılan savaş; a) kültürel önlemler, b) fiziksel önlemler, c) kimyasal savaş, d) biyolojik savaş olmak üzere 4 ana başlık altında toplanabilir. Bunlardan kimyasal savaş, gelişmekte olan ülkelerde en çok uygulanan yöntemdir.
Tarihsel gelişim içinde fiziksel ve kültürel uygulamalar yaygın bir şekilde kullanılmıştır. Fiziksel savaş olarak hastalık ve zararlıların yayılmasını önlemek için ürünün yakılması, duman, ses, korkuluk gibi uygulamalarla kuşların ve bazı böceklerin kaçırılması vb. yöntemler anlaşılmaktadır. Kültürel önlemler ise eski çağlarda rotasyon uygulaması şeklinde görülmüştür. Belirli ürünlerin aynı tarlada uzun yıllar ekilmesi sonucu o bitkiye özgü hastalık ve zararlılar iyice yaygınlaşmakta, ancak tarlada başka ürün yetiştirildiğinde eski bitkiye özgü hastalık ve zararlılar artık etkili olamamaktadır. Rotasyon, sadece hastalık ve zararlılara karşı değil toprağın fiziksel ve kimyasal yapısını korumak için de uygulanan bir yöntemdir ve çağdaş tarım tekniği olarak halen kullanılmaktadır. Özellikle hastalıklara dayanıklı bitki türlerinin geliştirilmesi ve bunların ekilmesi ile artık pek çok hastalık etkisini yitirmiştir. Bunun en iyi örneği floksera hastalığına dirençli asmaların ekilmesidir.
Kimyasal savaşta kullanılan ilaçlar kimya endüstrisine paralel olarak hızla gelişmektedir. Kimyasal preparatların kullanımındaki fazlalık; ilacın hızla etki etmesi ve kullanımında küçük çiftçi açısından kolay olmasından kaynaklanmaktadır.
20. Yüzyılın ortalarına doğru kimyasal savaş ilaçlarının üretimi ayrı bir endüstri halini almıştır. Günümüzde 1000'e yakın kimyasal madde ve bunların 60.000 kadar değişik formülasyonu hastalık ve zararlılara karşı kullanılmaktadır.
Tarımsal savaşta kullanılan ilaçlara genel olarak pestisit adı verilir. Pestisit "hastalık öldürücü" anlamına gelir. Pestisitler içinde; insektisitler (böcek öldürücüler), herbisitler (zararlı ot öldürücüler) ve fungisitler (küf öldürücüler) en yaygın olarak kullanılan ilaçlardır.
Bununla beraber kimyasal ilaçların kullanımında aşağıda belirtilen sakıncalar da vardır.
- İnsanlar üzerinde ölüme kadar giden olumsuzluklar görülmektedir. Bu ilaçlar doğrudan insanları zehirleyebildiği gibi ürün üzerinde kalan ilaç artıkları da sorun çıkarmaktadır. Bunların dışında ilaçların yağışlarla yıkanması, nehir, göl ve hatta denizlere taşınması, burada yaşayan deniz hayvanları aracılığı ile yine insanlara zarar vermektedir. Ayrıca ilaçlanmış tarladaki otlarla beslenen hayvanların et ve sütleri ile ilaçlar yine insan bünyesine girmektedir.
- Doğal denge tümüyle bozulmaktadır. İlaçların çoğu sadece zararlı böcek için değil pek çok canlıya zarar vermektedir. Örneğin tarla ve bahçedeki zararlı böcekleri yiyen diğer hayvanlar da ilaç etkisi ile yok olmaktadır.
- Böcekler zaman içinde ilaçlara alışmaktadır. Bu durum ise daha çok ilacın kullanılmasını gerektirmekte, böylece insanların ve doğanın daha çok zarar görmesini ortaya çıkarmaktadır.
Kimyasal ilaçların bu olumsuzlukları nedeniyle özellikle gelişmiş ülkelerde tarımsal savaşta yeni yaklaşımlar aranmış, kültürel, fiziksel ve biyolojik savaş yöntemleri üzerinde çalışmalar yoğunlaşmıştır.
Bugün bakteri, küf, protozoa ve virüslerden oluşan 1500 kadar entomopatojen bilinmektedir. Entomopatojen, böcekleri hastalandırarak öldüren mikroorganizma anlamına gelmektedir. Biyoinsektisit ise bu mikroorganizmaların tarımsal savaşta kullanılacak şekilde endüstriyel boyutta hazırlanmış preparatlarına verilen isimdir.
Bir entomopatojenin biyoinsektisit olarak kullanılması için bazı koşulları sağlaması gereklidir. Bunlar:
a) Sürekli ve teknik üretime elverişli olmalıdır,
b) İnsanlara, hedef canlının dışındaki canlılara ve bitkilere toksik etki yapmamalıdır,
c) Hedef canlıya (böceğe) karşı etkisi yüksek olmalıdır.
Entomopatojenler üzerindeki çalışmalar 1940'lı yıllarda başlamış, 1960'lı yıllarda ise yoğun araştırmalar yapılmıştır. Bugün pek çok ticari firma biyoinsektisit üretmektedir. Biyoinsektisitler özellikle çevre koruma bilincinin yerleşmesi ile önem kazanmışlardır.
Kimyasal ilaçlar ile kıyaslandığında biyoinsektisitler tam tersine olarak; çevreyi kirletmezler, sadece hedef canlıyı öldürürler, kendilerine karşı bir bağışıklık oluşmaz, ancak dezavantaj olarak etki süreleri daha uzundur. Bu geç etki etme dezavantajı biyoinsektisitlerin kimyasal ilaçlara göre daha az kullanılmasına neden olmaktadır.
02. Entomopatojen Mikroorganizmalar
02.01. Bakteriler
Zararlı böceklerin kontrolünde Bacillus cinsinden bakteriler kullanılmaktadır. Bu alanda kullanılan bakterilerin sporlu olmaları dikkat çekicidir. Sporlu bakterilerin kolayca ve büyük miktarlarda üretilebilmeleri ticari amaçla kullanılmalarının başlıca nedenidir. Nitekim Steinhaus (1959) tarafından çok sayıda sporlu entomopatojen bakteriye ait bir liste hazırlanmıştır. Buna karşın spor oluşturmayan, oysa büyük miktarlarda üretilebilen hiçbir sporsuz bakteri ticari amaçlarla kullanılmamıştır. Bu durum, muhtemelen, sporsuz bakterilerin pratikte kolayca stabilize edilememelerinden doğmaktadır.
Bugün; insanlara, diğer omurgalılara ve bitkilere hiçbir zarar vermeyen ve Bacillus popilliae, B. thuringiensis ve B. moritai'den hazırlanan preparasyonlar kullanılmaktadır. B. popilliae sadece belli bir böcek türünün larvalarında üreyebilmektedir. B. thuringiensis ve B. moritai ise alışılagelmiş fermantasyon yöntemleri ile çoğaltılırlar. B. popilliae böceklerde "milky" hastalığının etkenidir. B. moritai ise ev sineği ve karasineğe patojendir. Günümüzde B. popilliae ve B. moritai'ye ait çeşitli preparatlar zararlı böceklerin kontrolünde kullanılmaktadır. B. thuringiensis delta endotoksin tabiatında, protein yapısında toksik kristaller halinde inklüzyon cisimleri oluşturur. B. thuringiensis'in böceklere toksik etkisi, bu kristallerin yenmesi sonucunda olmaktadır. Bazı B. thuringiensis suşları termostabil özellikte b-ekzotoksin oluştururlar. Ancak bu toksin, omurgalılar dahil birçok organizmaya da toksik etkilidir.
02.02. Virüsler
Böcek patologlarının çoğu, mikrobiyolojik insektisitlerin geliştirilmesi için virüslerin çok büyük bir potansiyele sahip olduklarına inanmışlardır. Çünkü entomopatojen virüsler spesifiktir ve ekonomik zararları yönünden önem taşıyan birçok böceğe karşı aktiftir. Yaklaşık 300 böcek türünde virüslerin hastalık yaptığı saptanmıştır ve şimdiye kadar 650 böcek virüsü tanımlanmıştır. Bu sayı her geçen yıl artmaktadır. Bu alanda en çok yararlanılan böcek virusları, protein yapısındaki inklüzyon cismi ile korunanlardır. Bu koruyucu cismi oluşturmayanlar "noninklüzyon viruslar" diye tanımlanırlar. Bugün entomopatojen virüsler viriyonun morfolojisi ve fizyo-biyokimyasal özellikleri esas alınarak yedi cinse ayrılmışlardır. Tüm cins adları için Latin adlandırması kullanılmış ve sonuna virüs sözcüğü eklenmiştir (örneğin: Baculovirus, Entomopoxvirus, iridovirus). Viral replikasyonun yeri de böcek virüslerinin tanımlanmasında sıklıkla kullanılan bir kriterdir (örneğin: Nükleer polihedrozis, sitoplazmik polihedrozis). Ayrıca inklüzyon cisimlerinin şekli de virusların tanımlanmasında önem taşır (örneğin; polihedrozis viruslarında inklüzyon cisimleri polihedron, granulozis virüslerinde ise ovoid şekillidir).
Nükleer polihedrozis ve granulozis virüsleri, spesifik ve güvenilir olmaları, virulans ve stabilite özellikleri ile viral insektisit olarak en çok tavsiye edilen virüslerdir.
Endüstriyel alanda bakteri ve küflerle kıyaslanacak olursa, spesifisiteleri nedeni ile böcek virüslerinin üretiminde daha büyük güçlükler vardır. Çünkü virüsler zorunlu hücre parazitidirler ve bu nedenle ancak in vivo üretilebilirler.
02.03. Küfler
Günümüzde böcek patojeni olan 500'den fazla fungus türü bilinmektedir. Biyoinsektisit olarak kullanılmaya uygun olan fungus türlerinin çoğu Phycomycetes ve Deuteromycetes sınıflarındandırlar. Ancak zararlı böceklerin kontrolünde fungusların yararlılığı sık sık tartışılmaktadır. Bazı mikologlar böcekleri infekte eden fungusların doğada her yerde bulunduğunu ve böcek kontrolü için alan uygulamasının gereksiz olduğunu ileri sürmektedirler. Bir kısım mikologlar ise, eğer bir kimyasal insektisit ile karıştırılırlarsa ve uygun olarak kullanılırlarsa etkili olduklarına inanmaktadırlar.
Böceklerin kontrolünde başarılı sonuçlar veren funguslara örnek olarak; Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae, Entomophthora thaxteriana, Nomuraea rileyi verilebilir.
Entomopatojen fungusların bir özelliği de onların diğer entomopatojenlere oranla daha az spesifik olmaları ve sonuç olarak farklı türden birçok zararlı böceğe karşı kullanılabilmeleridir. Bu fungus türleri örneğin sinek, yaprak biti, tırtıl ve ürün deposu zararlılarına karşı başarı ile kullanılmaktadır.
02.04. Protozoonlar
Böcek protozoonları az virulan, stabil olmayan ve yalnız in vivo koşullarda üretilebilen mikroorganizmalar olduklarından kullanım alanı geniş değildir.
Böceklere etkili yaklaşık 300 protozoa türü belirlenmişse de bugün bunlardan sadece beşi mikrobiyolojik insektisit olarak kullanılmak üzere incelenmektedir. Nosema locustae kolayca üretilebilen bir protozoondur ve bitki zararlılarına karşı kullanılmaktadır. Mattesia trogodermae ürün deposu zararlılarına, Nosema algeae sivrisineklere, Vairimerpha necatrix soya fasulyesine zarar veren tırtıllara, Nosema (Perezia) pyrausta ise mısır kurduna karşı kullanılan böcek protozoonlarıdır.
03. Biyolojik İnsektisitlerin Üretimi
Entomopatojenler ya fermantasyon yolu ile (in vitro) ya da yaşayan böcekler üzerinde (in vivo) üretilirler. Derin veya yüzey fermantasyon yöntemleri fakültatif entomopatojenler (bakteri ve küfler) için, in vivo yöntemler ise zorunlu entomopatojenler (virüs ve protozoonlar) için uygulanır. Örneğin B. thuringiensis ve B. moritai bakterilerinin ticari üretimi için genellikle derin fermantasyon yöntemi seçilir, yüzey fermantasyonu ise B. bassiana ve Hirsutella thompsonii gibi funguslar için kullanılır. Genel olarak in vivo yöntemler sadece böcek virusları ve protozoonlar için kullanılıyorsa da bazı istisnalar da vardır. Örneğin; B. popilliae bakterisinin sporlarından oluşan insektisit canlı böcek larvalarında üretilebilmektedir.
Yöntem ne olursa olsun, ilk olarak böcek patojeni olan mikroorganizma bol miktarda üretilir, cam şişelere dağıtılarak liyofilize edilir. Üretim için daima bu referans suşlar kullanılır. Bakteriyel entomopatojenler elde edilirken bu şişelerdeki liyofilize kültürden yatık besiyerlerine ekim yapılır ve bunlar başlangıç inokülümü olarak kullanılır. Yüzey ve derin fermantasyon yöntemlerinde başlangıç inokülümünden önceki aşamalar aynıdır, ancak üretim ve ürünü elde etme işlemlerinde önemli farklar vardır.
Fermantasyon için çeşitli karbon (melas, glikoz, tahıl ezmesi, tahıl ürünleri) ve azot (pamuk tohumu, balık, soya fasulyesi, maya, kazein hidrolizatı) kaynakları kullanılır. Gerekiyorsa ana mineraller ve üreme faktörleri de ilave edilir.
Fermantasyon sonunda oluşan ürün santrifüj, filtrasyon, presipitasyon veya püskürterek kurutma gibi işlemlerden biri veya bu işlemlerin bir kombinasyonu ile elde edilir. Fermantasyon tipine, yöntemin ekonomik oluşuna veya spesifik formülasyon gereksinimine bağlı kalınarak, uçucu sıvı, suda eriyebilen pudra, toz veya granüler ürün haline getirilir, aktivite tayini yapılarak piyasaya verilir.
Entomopatojenlerin in vivo olarak üretilmesinde ilk kez tırtıl larvaları kullanılmıştır. Bugün ise tırtıl larvalarının yanısıra, güve, pamuk kurdu ve sivrisinek larvalarından yararlanılmaktadır. Larvaların üretimi için belirli koşulların sağlandığı insektoryumlar ve özel bir diyet hazırlanır. İnsektoryumlarda hastalıksız ve standart olarak elde edilen larvaların %95'i üretilecek entomopatojen virüs (veya protozoon) ile enfekte edilir, kalanı ise böcek kültürünün devamlılığını sağlamak üzere muhafaza edilir. Entomopatojen tarafından öldürülen larva hücrelerinden bir emme tüpü vasıtası ile mikroorganizmalar toplanır ve ticari preparasyonlar haline getirilir.
Entomopatojenler yaşayan, çoğalan, infeksiyöz özellik taşıyan varlıklardır. Organizmalara infektif olma ihtimali göz önüne alınarak, spesifiteleri daima titizlikle incelenmelidir. Bu nedenle ticari ürün haline getirilmeden önce her bir entomopatojen ile aşağıdaki deneyler yapılır;
a-) Akut toksisite-patojenite: Omurgalı ve omurgasızlarda sindirim, solunum ve deri toksisite deneyleri yapılır. Deney hayvanları üç hafta gözlem altında tutulur.
b-) Subakut toksisite-patojenite: Akut toksisite-patojenite deneyinden sonra geliştirilir. Deney süresi 13 haftaya kadar uzatılabilir.
c-) Primer irritasyon: Deney hayvanı olarak sıklıkla tavşanlar kullanılır. En fazla göz mukozası pestisitlerle karşı karşıya geldiğinden irritasyon gözde veya ender olarak deride denenir.
d-) Teratojen özellik: Deneyde dişi sıçanlar veya fındık fareleri kullanılır. Özellikle nükleer polihedrozis viruslarının organogenezis esnasındaki deney hayvanında teratojen etkisi araştırılır.
e-) Karsinojen özellik: Karsinojen (kanser yapıcı ; kanserojen) özellik sadece birkaç entomopatojen virüste saptanmıştır. Deney hayvanı olarak genç fare veya fındık fareleri kullanılır. Deney süresi 18-24 ay kadardır.
f-) Omurgasızlara spesifisite: Üretilen her bir biyoinsektisitin yararlı artropotlara ve omurgasızlara karşı akut toksisite özelliği araştırılır.
g-) Fitotoksisite: Fitotoksisite deneyleri çoğunlukla geniş alanlarda yetiştirilen ve ekonomik önemi olan bitkiler üzerinde yapılır.
04. Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis'in yaygın olarak kullanıldığı yerler yonca, enginar, pamuk, fasulye, lahana, karnabahar, kereviz, salatalık, marul, kavun, patates, ıspanak, tütün, tatlı mısır gibi tarla ve bahçe bitkileri, portakal, elma, üzüm, limon gibi meyveler ile orman ağaçları ve süs bitkilerindeki çeşitli böceklerdir. Bunların dışında bal arısı kovanlarında görülen büyük mum güvesine karşı da kullanılmaktadır.
B. thuringiensis grubu bakteriler aerobik, hareketli, çubuk şeklinde Gram ve katalaz pozitif, endospor oluşturan, fermantatif, mikroaerofilik ve anaerobik koşullarda üreme yeteneğine sahiptir. Bunlar aerobik koşullarda spor meydana getirmektedir. Taksonomik olarak Bacillus cereus ile yakından ilgilidir. Ancak B. thuringiensis serotipleri spor oluşum aşamasında delta toksin veya parasporal kristalin bulunuşu ile karakterize edilmektedir. Bu yapı diğer hücre materyalleri gibi boyanmakta, eksosporium oluştuğunda serbest halde görülmekte, sporlardan kolaylıkla ayrılmaktadır.
B. thuringiensis'in tanısı ise parasporal kristal oluşumundan başka diğer toksinlerin üretimine, esteraz tiplerine, vegetatif hücrenin flagella antijenlerine göre yapılmaktadır. Flagella antijenlerine göre yapılan sınıflama bunların biyokimyasal özelliklerinin de irdelenmesini gerektirmektedir.
04.01. Kristal Toksinin Etki Mekanizması
B. thuringiensis‘in ticari preparatlarında insektisidal aktiviteyi sporulasyondan sonra oluşan kristal protein göstermektedir. Bu kristal yapıya parasporal yapı, delta toksin gibi, çeşitli adlar verilmektedir. Hücrelerin sporulasyondan sonra ortaya çıkan lize sonucu spor ve kristal ortamda serbest halde kalır.
B. thuringiensis'in parasporal kristal içeren suşları genellikle Lepidopterler (kelebekgiller) üzerine etkilidir. Bu kristaller konuk larvalar tarafından alındıktan sonra toksik etki göstermekte ve ölümle sonuçlanan paralize neden olmaktadır.
Kristal toksinler birçok koşulda stabilitelerini korumakta, özellikle vertabratlar (omurgalılar) ve diğer canlılar tarafından alındıklarında bunların bağırsak sistemlerinden, yapılarında değişme olmadan geçmekte veya sindirim sisteminin asidik salgıları ile inaktive olmaktadır. Parasporal kristalin en düşük çözünme pH'sı 8,9'dur. Lepidopterlerin pek çoğunda sindirim öz suyu pH'sı 10,2-10,5 arasında değişmektedir. Bu durumda kristal çözünmekte ve toksin proteolitik enzimler tarafından serbest bırakılmaktadır. Yapılan araştırmalar farklı zararlıların enzimlerinin parasporal kristalden farklı polipeptitleri serbest bıraktığını ortaya çıkarmıştır. Toksinin larva tarafından alınmasından yaklaşık 1 saat sonra sindirim sistemi paralizi ortaya çıkmakta, bunu metabolik yıkımla beraber bağırsak epitelinin dejenerasyonu izlemektedir. Paraliz, kan pH'sının hızla yükselmesi ile paralellik göstermektedir.
Kristalin kalitatif analizlerine göre yapının proteinden oluştuğu, nükleik asit ve lipit içermediği ortaya konmuştur. Karbohidratlar bakımından suşlara göre farklı bulgular mevcuttur. Örneğin, B. thuringiensis var. thuringiensis toksininin %12 karbohidrat içerdiği, glikoz, mannoz, ksiloz ve arabinozdan oluştuğu; B. thuringiensis var. sotto kristallerinin %3,0; B. thuringiensis var. kurstaki kristalinde %1,2 karbohidrat bulunduğu gösterilmiştir.
Çeşitli serotiplere ait kristallerin aminoasit içeriklerinin farklı olduğu, metiyonin oranının düşük, asparagin, glutamik asit, glisin ve lösin oranının fazla olduğu saptanmıştır.
Farklı serotiplerin kristal bileşimi, çeşitli zincirlerin miktarı, toksinin çözünürlüğü, konakçı böceklerin sindirim sistemindeki enzimlerle ilgilidir.
Sporlanma sırasında B. thuringiensis parasporal glikoprotein kristalinin sentezlendiği, bunun bir protoksin olduğu, zararlının sindirim sistemi içinde alkali pH‘da eriyerek aktif hale geçtiği gösterilmiştir.
Diğer yandan B. thuringiensis serotiplerinde farklı toksinler tanımlanmıştır. Bunlar sırası ile lesitinaz C, termostabil eksotoksin, endotoksin ve labil eksotoksindir. Toksinlerin etki mekanizması genellikle benzer şekilde seyretmektedir. Toksin, sindirim sistemi epitel hücrelerinin yüzeyinde glikoz alımını engellemekte, solunum hızı artmakta sonuçta ATP'nin hızla kaybolması sonucu enerji yetmezliği ortaya çıkmakta, mikrovilli şişmekte ve daha sonrada bu olay diğer epitel hücrelerinde görülmektedir. Epitel hücrelerinin metabolik yıkımı 10-15 dakika içinde tamamlanmakta sindirim boşluğundan konakçının kan dolaşımına iyon akışı hızlanmakta, paraliz veya ölüm kandaki iyon dengesizliğinden kaynaklanmaktadır.
04.02. Preparatlar Üzerine Çevre Faktörlerinin Etkisi
B. thuringiensis'ten elde edilen preparatların biyoinsektisidal gücü üzerine çevresel faktörler etki yapar. Bu etkenler arasında hava koşulları (nem, sıcaklık, rüzgâr, ışık, yağış ve radyasyon) zararlının yaşam yeri (habitatı), zararlının beslenme durumu en önemli olanlarıdır. Bu etkenler doğrudan doğruya biyoinsektisidin etkisini azaltabilmekte veya zararlıya karşı olumsuz etki yaparak bu kez dolaylı olarak biyoinsektisidal etkiyi artırmaktadır.
05. Endüstriyel Üretim
05.01. İzolasyon
Hedef zararlıya karşı etkili entomopatojenin izolasyonu için kuşkusuz doğadan ölü zararlıları toplamak, bakteriyi buradan izole etmek gerekir. Bir diğer deyiş ile B. thuringiensis'in doğada en çok bulunduğu yerden yani etki ederek öldürdüğü larvalardan izole edilmesi gerekir. Bu amaçla laboratuvara getirilen ölü larvalar steril damıtık su ile yıkanır, sonra yüzey sterilizasyonu için %2,5 hipoklorit içinde 1 dakika tutulur, tekrar steril su ile yıkanır ve 65 °C‘ta 20 dakika su banyosunda tutularak zararlı içindeki vejetatif hücrelerin ölmesi sağlanır. Sonra steril bir baget yardımı ile 1 mL kadar steril fizyolojik tuzlu su içinde ezilir ve buradan Nutrient Brotha ekim yapılarak 32 °C‘ta 48 saat tutulur. Daha sonra Nutrient Agar üzerine sürme yapılarak tek koloniler elde edilir. Morfolojik karakter bakımından B. thuringiensis olduğu kanısına varılan kolonilerden Nutrient Brothda tekrar üretilir ve yine Nutrient Agara sürülerek saflık kontrolü yapılır. Morfolojik özellikler olarak Gram boyama, spor boyama ve hareketlilik testleri yapılır, kültürel özellikler olarak Nutrient Agardaki koloni şekilleri, Nutrient Brothda gelişme ve NaCl içeren Nutrient Brothda üreme durumlarına bakılır; fizyolojik özellikler olarak oksijen istekleri, kazein, yumurta sarısı, jelatin, üre ve nişastayı hidrolize etme durumları, indol, VP testleri, şekerlerin kullanımı, nitrat redüksüyonu, katalaz, arjinin hidrolaz ve Tween esteraz reaksiyonları incelenir.
05.02. Etkili İzolatların Belirlenmesi
Örneğin un güvesine karşı etkili olan B. thuringiensis suşlarının etkinliği kontrol edilmek isteniyorsa kavanozlara un güvesi için besin ortamı olarak un, belirli sayıda un güvesi ve bakteriden elde edilen toz preparattan belirli bir miktar konulur. Larvalar 15 gün süre ile izlenir, kontrol kavanozundaki ölü sayısı ile kıyaslanarak hangi suşların etkili olduğu ortaya konulur. Etkili izolatlar yeniden aynı şekilde denenerek etkileri kontrol edilir.
05.03. Toz Preparat Hazırlanması
İzolatlar 150 mL Nutrient Broth besiyerinde çalkalamalı inkübatörde 72 saat süre ile 32 °C‘ta ve 150 d/d çalkalama hızı ile tutulur. Sonra sporlandırma ortamına alınır ve burada 18 saat süre ile 32°C’ta %90 nemde bırakılır. En son olarak 55 oC‘ta 48 saat süre ile kurutulur, öğütülür ve 100 mesh elekten geçirilerek toz preparat elde edilir.
05.04. Ticari Üretim
Endüstriyel boyuttaki üretimlerde özellikle besiyeri giderleri maliyeti önemli ölçüde etkiler. Bu nedenle et artıklarından pepton, nişastadan glikoz elde edilmesi gibi uygulamalar da üretim teknolojisi içinde yer alır.
Bunun dışında sporlandırma ortamı olarak buğday kepeği, soya unu, perlit, kalsiyum klorür, tuz gibi ucuz olarak bulunan girdiler kullanılır.
Üretimde nem ve sıcaklık kontrolü yapılabilen, dışardan steril sıcak hava verilerek kurutmanın sağlanabildiği kabinler kullanılır.
B. thuringiensis üretiminde genelde iki yöntemden yararlanılmaktadır. Bunlar yarı katı fermantasyon ve derin kültür üretimidir. Yarı katı fermantasyon yönteminde mikroorganizmaların gelişmeleri için aerobik koşullar uygulanmakta olup yeterli havalanma sağlanmaktadır. Yarı katı fermantasyon yüzey kültüründe mikroorganizmaların gelişmeleri için gerekli oksijen rahatlıkla temin edilebilmektedir. Besiyeri olarak 15 g glikoz, 5 g mısır ıslatma suyu ekstraktı, 5 g maya ekstraktı, 4 g K2HPO4 ve 1 litre damıtık su kullanılmakta ve pH 7,0-7,2 arasında tutulmaktadır. Daha büyük üretimler için katı besiyeri hazırlanmakta, bunun bileşiminde ise buğday kepeği, perlit, soya unu, glikoz, kireç, tuz, kalsiyum klorür ve belirli miktar su bulunmaktadır. Sonuçta karışımın içindeki nem oranı %60 olarak ayarlanmaktadır. Daha sonra dipten havalandırmalı özel tavalara yerleştirilmekte ve bu katı destek maddeler üzerine sıvıda geliştirilmiş B. thuringiensis vejetatif hücreleri ilave edilmektedir.
Kaynak: Halkman, A.K. 1991. Tarım Mikrobiyolojisi. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları Ders Kitabı no 350. Ankara Üniversitesi Baskı Ofset Ünitesi. Ankara, 82 sayfa.