Rhizobiyoloji

Rhizobiyoloji

Rhizobiyoloji; Simbiyotik Azot Tespiti (Fiksasyonu)

01. Genel Bilgiler
02. Rhizobium Bakterileri
02.01. Taksonomi
02.02. Rhizobium Suşlarının İzolasyonu
03. Azot Tespit Mekanizması
04. Azot Fiksasyonunu Etkileyen Faktörler
04.01. Bitkisel Faktörler
04.02. Bakterilerden Kaynaklanan Faktörler
04.03. Çevre Faktörleri
05. Biyolojik Gübre
05.01. Suşların Seçimi
05.02. İnokülant Üretimi
05.03. Biyolojik Gübrenin Uygulanması

01. Genel Bilgiler

Bitkisel üretimin en önemli girdilerinden birisi gübredir. Doğal çevrim ve ekolojik denge altında bitkilerin gübrelenmesine gerek yoktur. Bitki gelişmesinde gerekli olan maddeler toprakta bulunur.

Bitkiler, geliştikleri topraktan bu maddeleri alırlar ve öldükleri zaman yine toprağa bırakırlar. Bu çevrime hayvanlar da katılırlar ve topraktaki madde miktarı sabit kalır.

Ancak besin maddelerinin bu çevrimi insan müdahalesi ile bozulur. Önce insanlar topraktaki doğal bitki örtüsünü sökerler ve buraya kendi istedikleri bitkileri ekerler, bitkiler yetiştiklerinde bunları hasat ederek topraktan uzaklaştırırlar. Bu şekilde toprakta bitkilerin yetişmesi için gerekli olan besin maddeleri sürekli azalmış olur.

İnsanların, bitkilerin daha iyi gelişmesi için dışarıdan toprağa katılan maddelerin faydasını fark etmesi hemen hemen insanlık tarım tarihi kadar eskidir. Meralarda hayvan dışkılarının düştüğü yerlerde bitkilerin daha iyi yetiştiğini fark eden insanlar bu dışkıların kültür topraklarına verilmesinin yararını anlayabildiler. Benzer şekilde bitki artıklarının da gübre olarak kullanılması oldukça eskidir. Bu konudaki yazılı veriler MÖ. 800-1000 yıllarına kadar uzanır.

Bilimsel yöntemlerle gübre kullanımı 19. Yüzyılın ikinci yarısında başlamıştır. Bugün, tarımda kullanılan gübreler kimya endüstrisinin oldukça gelişmiş tesislerinde üretilmektedir. Günümüzde, çağdaş bilimsel analizler ışığında topraktaki tüm besin maddelerinin analizi yapılabilmekte, yetiştirilecek ürün cinsi, iklim, sulama gibi faktörler dikkate alınarak gereken miktarda besin maddeleri verilebilmektedir. Bununla birlikte ticari olarak hazırlanan gübrelerde tüm besin maddeleri değil azot, fosfor ve potasyum bulunmaktadır.

Gübrelerin, sadece bitkinin gereksindiği kadarını toprağa vermek olanaksızdır. En azından, sadece kök çevresine gübre verilemez. Bu durumda gübrenin bir kısmını bitki kullanamayacaktır. Toprağa fazla olarak verilen bu miktar ise sulama ve yağışlar ile toprağın alt katmanlarına geçerek drenaj sularına karışır.

Kimyasal gübrelerin bileşiminde bulunan azot, su sistemlerine karıştığında önemli boyutlarda kirlilik oluşturur. Bu kirlilik, bir yandan nitrat bileşiklerinin doğrudan insan (özellikle çocuk) ve besi hayvanları sağlığına olan olumsuz etkisi, diğer yandan eutrofikasyon (besin maddelerinin zenginleşmesi sonucu su bitkilerinin hızla gelişmesi) olarak dikkati çeker.

Azot ve su, bitkisel üretimde en sık karşılaşılan sınırlayıcı faktörler arasındadır. Üreticinin en önemli sorunları arasında bitkilerin özümleyebileceği yapıdaki azotu, gerektiğinde kullanmak üzere toprakta depolayarak korumaktır.

İnsan ve hayvan beslenmesinde yapı maddesi olarak görev yapan proteinlerin en önemli elementlerinden biri olan azot, havada %80'e yakın oranda bulunmakla beraber, yüksek canlılar bu moleküler azottan yapı maddesi olarak aminoasit ve proteinleri doğrudan oluşturamazlar. Bitkiler de atmosferdeki azottan doğrudan yararlanamazlar. Ancak bitkiler, gelişmeleri için gerekli olan azotu, nitrat ve amonyak gibi basit azot bileşiklerinden sağlamakta, bunu fotosentez yoluyla elde ettikleri karbohidratlar ile sentezleyerek, insan ve hayvan gelişmesi için gerekli olan aminoasitleri, peptitleri ve nihayet proteinleri oluşturabilmektedirler. Bu durumda insan ve hayvan beslenmesi sorunu bitkilerin azot gereksinmelerinin karşılanmasına bağlı görülmektedir.

Toprak, farklı şekillerde azot bakımından zenginleşir. Bitki ve hayvan artıklarının (hasat sonu sap saman vs. bitki kalıntılarının toprakta bırakılması, hayvan dışkısı, ölü hayvan leşleri) toprakta kalması, kimyasal azotlu gübre ilave edilmesi, çeşitli motorların çalışması ve biyolojik azot fiksasyonu ile doğrudan ve dolaylı şekillerde bir yıl süre içinde dünya yüzeyinde 260 milyon ton azotun tespit edildiği tahmin edilmektedir. Bu miktar içinde biyolojik azot tespiti 175 milyon ton ile %67 kadar pay alırken bunu 40 milyon ton ile (%15) kimyasal gübreler izlemektedir. Biyolojik olarak tespit (fikse) edilen azotun %50 'si ise (90 milyon ton) Rhizobium bakterileri ile baklagiller arasındaki simbiyotik yaşamdan kaynaklanmaktadır. Simbiyotik yaşam, iki canlının bir arada yaşamaları ve her ikisinin de birbirlerinden yararlanmaları anlamına gelir.

Biyolojik yolla azot tespiti mikroorganizmalar tarafından yapılır. Mikroorganizmaları serbest yaşayanlar ve simbiyotik yaşayanlar olarak iki grupta toplamak mümkündür. Serbest yaşayan mikroorganizmalardan aerobik bakterilerden olan Azotobacter türleri (Azotobacter chrococcum, A. agilis, A. vinelandii, A. inginis vd.), anaerobik bakterilerden Clostridium türleri (Clostridiumpasterianum, C. butyricum, C. pectinivarum vd.), fotosentetik ototrofik bakterilerden Rhodopseudomonas, Rhodospirillum türleri, kemotrofik bakterilerden Thiobacillus türleri, bazı siyanobakterler sayılabilir. Bunların toprağa azot fikse etme güçleri zayıf olduğu gibi çevresel faktörler de fiksasyonu önemli ölçüde etkilemektedir. Örneğin bu mikroorganizmalar arasında en çok azot tespit eden Azotobacter türlerinin 1 yılda hektar başına 20 kg azot tespit edebilmesi için 1 ton organik maddeyi okside etmeleri gereklidir. Bir diğer yaklaşımla bunlar 100 kısım karbohidrata karşılık 1-1,5 kısım azot tespit edebilmektedirler. Oysa baklagillerle simbiyotik olarak yaşayan Rhizobium bakterilerinin toprağa fikse ettikleri azot miktarı ortalama 200 kg/ha/yıl dır. Bu miktar; bitki iyi bir gelişme gösterirse, azot fikse etme gücü yüksek suş ile simbiyotik yaşama girerse ve toprak azotlu gübre bakımından fakir ise 500 kg/ha/yıl değerine kadar çıkabilmektedir.

Toprakta yeterli azotlu gübre bulunuyorsa ya da toprak azot bakımından yeterli ise baklagil- Rhizobium simbiyozu meydana gelmez. Yani bitki toprakta hazır bulunan azotu almayı tercih eder.

Öte yandan bitkide bulunan azotun %60-90 kadarı hasat ile uzaklaştırılmaktadır. Fikse edilen azotun bir kısmı ise tarlada kalan bitki artıkları ile toprağa kazandırılmaktadır. Bununla beraber tarlada kalan baklagil kökleri, kendilerinden sonra ekilecek olan örneğin, buğdaya yeterli miktarda azot sağlayamamaktadır. Ancak rotasyon bitkisi olarak ekilen baklagillerden, toprağa bırakılan gövde-yaprak kısımları kayda değer miktarda azotu toprağa kazandırmaktadır. Bunun yanında mera olarak kullanılan alanlarda eğer hayvanlar uzun süre otlatmada tutulursa, baklagil tarafından fikse edilen azot hayvan dışkıları ile toprağa geri dönmektedir. Bu durumda baklagillerin başka bitkilerin gereksinimleri için değil, kendi gereksinmeleri için azot fikse ettikleri, hasat sonrasında baklagil artıkları ile toprağa bir miktar azot kazandırdığı anlaşılmaktadır. Önceleri Rhizobium- baklagil ortak yaşamı sonunda fikse edilen azotun doğrudan toprağa kazandırılıp, bitkinin oradan kendi gereksinimi olan azotu aldığı sanılıyordu. Ancak bugün azot fiksasyonunun doğrudan toprağa yapılmadığı, köklerde oluşan nodüller ile sadece bitkinin gereksindiği şekilde ve doğrudan bitkinin kendi kullanımına yönelik olarak bitkide fikse edildiği anlaşılmıştır.

Oysa, baklagil bitkilerinin münavebede kullanılması halinde kendinden sonra gelen bitkinin verimini artırdığı Roma İmparatorluğu zamanından beri bilinmektedir. Baklagillerin buradaki etkisi, toprağa kendinden sonra gelecek bitki için gerekli azotu kazandırmak değil, derine giden kökleri ile toprağın fiziksel yapısını iyileştirmektir.

02. Rhizobium Bakterileri
02.01. Taksonomi
Rhizobium cinsi bakteriler Rhizobiaceae familyasına dahildirler. Bunlar genetik olarak farklı, fizyolojik olarak heterojen bir grubu oluştururlar.

Bunlar çubuk şeklinde, spor oluşturmayan, Gram negatif, genel olarak aerobik metabolizmaya sahip olmakla beraber çok düşük oksijen varlığında da gelişebilen bakterilerdir. Optimum gelişme sıcaklıkları 25-30 °C, gelişme pH'ları 6-7 arasındadır. Bazı suşlar gelişmeleri için vitaminlere ihtiyaç duyarlar.

Rhizobium cinsine giren bakterilerin sınıflandırılması henüz tamamlanmamıştır. Sınıflamada esas olan ayrım baklagil çeşitlerinde nodül oluşturma yeteneğidir. Bu şekilde yapılan ayrım "çapraz aşılama gruplarına göre" yapılan sınıflama şeklidir. Rhizobium bakterilerinin çeşitli baklagillerde nodül oluşturmaları bir diğer deyişle baklagil çeşitlerini enfekte etme özellikleri spesifikdir. Buna göre;

baklagillerini enfekte ederek nodül oluştururlar. Bununla beraber yeni bilimsel gelişmelerin ışığı altında sınıflama devam etmektedir.

Rhizobium türlerinin bazıları hızlı gelişip asit oluştururlar. Bunlarda ortalama generasyon süresi 2-4 saat kadardır. Bazıları ise yavaş gelişip alkali oluştururlar, generasyon süreleri ortalama 6-7 saattir. Rhizobium japonicum ikinci grupta yer alırken, hızlı gelişip asit oluşturan ve soyada nodül meydana getiren suşların bulunması sınıflamada değişiklik gereksinimini ortaya çıkarmıştır. Buna göre, soyayı enfekte edenler hızlı gelişen ve asit oluşturan Rhizobium japonicum ile yavaş gelişen ve alkali oluşturan Bradyrhizobium japonicum olarak ikiye ayrılmıştır. Bunun dışında cowpea grubu diye adlandırılan grup üzerinde yoğun sınıflandırma çalışmaları yapılmaktadır.

02.02. Rhizobium Suşlarının İzolasyonu
Çeşitli çalışmalarda kullanılmak üzere Rhizobium suşlarının izolasyonu gerekebilir. Tüm mikrobiyolojik çalışmalarda olduğu gibi izole edilmek istenen mikroorganizma, en çok ve en yaygın olarak bulunduğu ortamdan elde edilir. Rhizobium için bu ortam baklagil bitkisinin köklerinde oluşturduğu nodüllerdir.

Tarladan toplanan nodüllü kökler laboratuvara getirilir, önce musluk suyu ile yıkanarak toprak ve diğer kalıntılar uzaklaştırılır, sonra alkol içinde 5-10 saniye tutularak yüzey sterilizasyonu yapılır, steril su ile yıkanarak alkol uzaklaştırılır. Daha sonra her nodül 1-2 damla steril fizyolojik tuzlu su içinde steril bir baget ile ezilir, buradan kongo kırmızısı indikatörü içeren YMA (Yeast Mannitol Agar) besiyerine sürme yapılır ve 25-30 °C'da 4-10 gün süre ile inkübe edilir. İnkübasyondan sonra elde edilen tek koloniler identifikasyon işlemlerine alınır.

Tarla toprağından Rhizobium izole edilmek isteniyorsa 2 yöntem vardır. 1. yöntemde toprak örneği doğrudan doğruya steril fizyolojik tuzlu su ile karıştırılır, böylece toprakta bulunan bakterilerin sıvıya geçmesi sağlanır, buradan YMA besiyerine sürülerek koloni elde edilir. Bu yöntemde elde edilen kolonilerin Rhizobium olup olmadığı, Rhizobium ise ne denli etkili bir suş olduğu, hangi baklagillerle çapraz aşılama reaksiyonu vereceği bilinmediğinden etkili bir yöntem değildir. Bunun yerine diğer yöntem daha iyidir. Bu yöntemde yine toprak steril fizyolojik tuzlu su içinde karıştırılır. Hangi baklagil için Rhizobium izole edilmek isteniyorsa o baklagilin tohumları ile elde edilen toprak ekstraktı karıştırılarak laboratuvar veya sera koşullarında ekilir. Bitki gelişmesi sağlandığında köklerde oluşan nodüllerden yukarıda açıklandığı şekilde bakteri izole edilir.

02.03. Rhizobium Sayımı
Saf bir Rhizobium kültüründe hangi sayıda bakteri olduğu direk mikroskobik sayım, katı besiyerinde kültürel sayım veya bitki enfeksiyon yöntemleriyle belirlenebilir. Belirli bir Rhizobium türünün sayımı için en uygun yöntem bitki enfeksiyon yöntemidir. Burada bitki enfeksiyon yöntemiyle yapılan kültürel sayım hakkında kısaca bilgi verilecektir.

Bir toprak örneğinde sadece seçilmiş baklagil bitkilerini enfekte eden Rhizobium suşlarının varlığı ancak o baklagillerin kullanılması ile yapılır. Örneğin bir tarla toprağında soya fasulyesini enfekte eden R. japonicum ile nohutu enfekte eden R. cicer bakterilerinden hangi sayılarda olduğu bitki enfeksiyon yöntemiyle en muhtemel sayının belirlenmesi ile yapılır. Yöntemin esası, sayımı istenen Rhizobium türünün nodül oluşturduğu baklagil bitkisinin çimlendirilmiş tohumuna bakterinin aşılanması, bitki gelişmesinin laboratuvar koşullarında tamamlanmasından sonra bitki köklerinde oluşan nodüllerin kontrolü, nodül oluşturan bitkilerin sayılması, özel olarak hazırlanmış tablolardan bu sayıya karşı gelen değerin en muhtemel Rhizobium sayısı olarak hesaplanmasıdır. Bitki enfeksiyon yöntemi ile yapılan bu sayımda bitkide oluşan nodüller sayılmaz, sadece kökünde nodül oluşturan bitkiler sayılır. Bu amaçla farklı şekillerde hazırlanmış deneme planları ve bunlara bağlı olarak farklı EMS tabloları kullanılmaktadır. Aşağıda bu konuda bir örnek verilmiştir.

Bu ekim yöntemi ve ilgili çizelgeye göre ardışık 4 dilüsyondan ekim yapılır, pozitif bitki sayısına göre Rhizobium sayısı hesaplanır. Örneğin, bir toprakta soya ve nohut baklagilleri için sırası ile kaçar adet R. japonicum ve R. cicer olduğu saptanmak isteniyorsa bu toprak örneğinden standart yöntemle dilüsyonlar hazırlanır, yüzey sterilizasyonu yapılıp uygun koşullarda çimlendirilmiş baklagil tohumları özel kavanozlara ekilir, her dilüsyondan 3‘er adet çimlendirilmiş baklagil için 1‘er mL ilave edilir ve bitkilerin gelişmesi beklenir. Bu aşamada çimlendirilmiş bitkilerin azot olmayan, ancak gereken mineralleri içeren kum ortamına ekilmesi önemlidir. Böylece bitki azot gereksinimini Rhizobium bakterileri ile simbiyotik yaşam ile sağlamaya zorlanır. Laboratuvar koşullarında bitki gelişmesini tamamladıktan sonra bitkiler kavanozlardan çıkartılır ve köklerinde nodül oluşup oluşmadığı kontrol edilir. Burada verilen örneğe göre soya ve nohut için Rhizobium sayıldığına göre her bitki için 4 dilüsyon ve 3 tohum olduğuna göre 12‘şer tohum kullanılmalıdır. Deneme sonucunda soya için sırası ile 3 3 1 0 ; toplam 7 bitkide pozitif sonuç alındı ise en muhtemel olarak toprağın 1 g ‘ında 42,4 adet Rhizobium japonicum bulunduğu belirlenir. Nohut için bu değerler 2 0 0 0 toplam 2 bitkide pozitif sonuç alındı ise bu değer 0,9 R. cicer olarak bulunur.

Burada dikkat edilmesi gereken husus dilüsyon kavramıdır. Yukarıdaki çizelge 10⁰ ; 10^-1 ; 10^-2 ; 10^-3 dilüsyonları için verilmiştir. 100 doğrudan denemeye alınan toprak anlamına gelir. Eğer denemeye alınan toprak doğrudan 1 g olarak ve ardışık seyreltileri 1 ml (yaklaşık 1 g) olarak kavanoza ilave ediliyorsa bu sonuçlar geçerlidir. Ancak 10^-2 ; 10^-3 ; 10^-4 ; 10^-5 seyreltilerden 1‘er mL ilave edildi ise bu kez tabloda seyreltme faktörü dikkate alınmalıdır. Bu durumda başlangıç dilüsyonu 10^-2 olduğuna göre yine 3 3 1 0 ve toplam 7 bitkide pozitif sonuç 42,4 olarak çizelgeden okunur. Ancak bu değer artık doğrudan denemeye alınan toprak örneğinde değil bunun 10^-2 seyreltisinde olan bir değerdir. Dolayısı ile standart seyreltme kuralları çerçevesinde çizelgeden elde edilen değer 1/10^-2 = 100 ile çarpılarak denemeye alınan toprakta değer en muhtemel olarak 42,4X100=4240 adet olarak verilir.

Çizelgede 10⁰ ; 10^-1 ; 10^-2 ; 10^-3 serisi için 1 2 0 4 ; 0 0 3 2 gibi pozitif sonuçlar gösterilmemektedir. Bunun nedeni bu tip sonuçların güvenilmez olmasıdır. Gerek dilüsyon kavramı gerek güvenilir sonuçlar konusunda bu sitenin gıda mikrobiyolojisi bölümünde EMS başlığı altında ayrıntılı bilgi verilmiştir.

Toprak örneklerinde bu tip sayım yöntemi benimsenirken, inokülantlarda daha farklı bir deneme planı ile sayım yapılmaktadır. Bu yöntemde inokülant 10^-1‘den başlayıp 10^-10‘a kadar standart şekilde seyreltilir. Her dilüsyondan yukarıda açıklandığı şekilde ancak bu kez 4‘er çimlendirilmiş tohuma ekim yapılır. Yine laboratuvar koşullarında olmak üzere bitki gelişmesini tamamladıktan sonra kavanozlardan sökülüp dilüsyonlara bakılmaksızın pozitif bitki sayısı belirlenir. Bu yöntemde ardışık 10 seyrelti ve her seyreltiden 4 tohum olmak üzere toplam 40 tohumda “bitki enfeksiyon yöntemi“ denenmektedir ve toplam 40 bitkinin kaç adedinin pozitif sonuç verdiği önemlidir. Pozitif bitki sayısına göre inokülantta en muhtemel olarak kaç adet Rhizobium olduğu aşağıdaki çizelgeden hesaplanır.

Bu örneğe göre 10^-1-10^-10 aralığında 4‘er çimlendirilmiş tohum olmak üzere toplam 40 ekim yapılan soya inokülantı için sonuçta 28 bitkide pozitif sonuç alındı ise, bir diğer deyiş ile toplam 28 bitkinin kökünde nodül alındı ise inokülantta en muhtemel olarak 1,7X10⁶ adet/g R. japonicum olduğu belirlenir.

03. Azot Tespit Mekanizması
Simbiyotik yaşam, bilindiği gibi, 2 canlı arasında karşılıklı çıkar sağlanan bir ortak yaşam şeklidir. Baklagil bitkisinin köklerine yerleşen Rhizobium bakterileri, bitki için gerekli azotu sağlarken bitki öz suyundan besin maddesi olarak yararlanırlar.

Bitkinin kök çevresinde (rizosferde) bulunan Rhizobium bakterileri ile baklagilin kökü arasında bir tanıma mekanizması vardır. Bu sistemde kök ucundan lektin adı verilen ve protein yapısında bir madde salgılanır. Rhizobium-baklagil kökü tanınmasını lektin sağlar. Baklagil çeşitlerinin salgıladığı lektinler arasında kimyasal farklılıklar olması Rhizobium-baklagil tanınmasında etkilidir. Bir diğer deyiş ile baklagil çeşidi-Rhizobium türü arasındaki spesifik ilişki baklagillerin kök ucu tarafından salgılanan lektinlerin farklı kimyasal yapısından kaynaklanmaktadır.

Rhizobium bakterileri toprakta doğal olarak bulunabilecekleri gibi özel hazırlanmış inokülantlar ile de çeşitli şekillerde toprağa verilebilir. Bazı baklagiller (örneğin börülce ve yerfıstığı) Rhizobium suşlarına karşı yüksek spesifiklik göstermezler. Yani bunlar farklı türlerdeki çeşitli suşlar tarafından enfekte olabilirler. Bu tip baklagiller için toprağa dışarıdan Rhizobium verilmesine gerek yoktur. Ancak soya fasulyesi yüksek spesifiklik gösterdiğinden bu baklagil için özel hazırlanmış inokülantların ilavesi gerekir.

Rizosfer bölgesinde bulunan ve lektin ile baklagili tanıyan Rhizobium bakterisi henüz tam olarak anlaşılamamış bir şekilde kökten içeri girer. Bu giriş ya kökçüklerin ucundan ya da yan kökçüklerin yüzeyindeki yaralardan olur. Bakteri kök içinde çoğalır, pleomorfi sonucunda şekil değiştirerek Y şekline dönüşür. Bu forma bakteroit denir. Bakteroit formuna dönüşümden sonra azot fiksasyonundan sorumlu olan nitrogenaz enzimi salgılanmaya başlar.

Azot fiksasyonu bitki gelişme devresinin yarısından sonra başlar, ürün oluşumu yani dane bağlama sırasında maksimuma ulaşır. Bir vejetasyon devresinde fikse edilen azotun %90'ı bu dönemde oluşur. Çünkü bitki bünyesinde azota en çok gerek duyulan bölge danedir.

Azot fiksasyonunun esası serbest azotun nitrogenaz enzimi aracılığı ile NH₃'a çevrilmesidir. Nitrogenaz enzimi, elektron transport sistemindeki elektronları N üzerine taşıyarak NH₃ oluşturur. Bu amonyak, aminoasitler haline dönüştürülerek bitki tarafından kullanılır. Bitkinin fotosentez yoluyla elde ettiği ürünlerin büyük bölümü yine bitki tarafından vejetatif gelişme için kullanılır, kalan kısmı ise NH₃'den aminoasitlere dönüşüm sırasında C iskeleti olarak ve bakterinin azot tespiti için gerekli enerji kaynağı olarak kullanılır.

N º N + 6e ^- + 6 H ⁺   nitrogenas  ®  2 NH₃

Her bir molekül azotun 2 molekül NH3‘a çevrilmesi için 5-12 arasında ATP'ye gerek vardır. Bu ATP fotosentez ürünü olan karbohidratların parçalanması sırasında açığa çıkar.

04. Azot Fiksasyonunu Etkileyen Faktörler
04.01. Bitkisel Faktörler
Toprakta bitkinin gereksindiği kadar azot varsa baklagil ile Rhizobium arasında simbiyotik yaşam gerçekleşmez ve bitki doğrudan doğruya toprakta hazır bulunan azotu kullanır. Fiksasyonda bitkinin genetik yapısı da etkilidir. Bazı bitkiler baklagil-Rhizobium tanınmasını sağlayan lektinleri daha az salgılayabilir, ya da azot fiksasyonu için gerekli fotosentez ürünlerinin Rhizobium ‘lara aktarılmasında aksamalar görülebilir. Bunların dışında bitkinin hastalık ve zararlı etkisine maruz kalması dolaylı olarak azot fiksasyonunu etkilemektedir. Örneğin sitona zararlısı mercimek nodüllerini yiyerek azot fiksasyonunu engeller.

04.02. Bakterilerden Kaynaklanan Faktörler
Bazı suşların azot tespit etme gücündeki düşüklük, rekabet gücündeki zayıflık azot fiksasyonunu olumsuz yönde etkiler. Toprakta doğal olarak bulunan Rhizobium bakterilerinin dışarıdan verilenlerle rizosfer bölgesindeki rekabetinde doğal suşların lehine bir durum görülmektedir.

10² adet/g sayıdaki doğal Rhizobium popülasyonunun dışarıdan verilen 10⁸ adet/g Rhizobium popülasyonunun önüne geçerek baklagilde nodül oluşturduğu yapılan araştırmalar ile gösterilmiştir.

04.03. Çevre Faktörleri
Toprağın ve havanın sıcaklığı, nem, deniz seviyesinden yükseklik, toprağın fiziksel durumu, asitliği, güneş ışınları gibi çevresel faktörler biyolojik azot fiksasyonunu etkilemektedir.

05. Biyolojik Gübre
Baklagillerle simbiyotik olarak yaşayan Rhizobium bakterilerinin seçilmiş suşları endüstriyel boyutta hazırlanır ve "biyolojik gübre (inokülant)" olarak baklagil yetiştirilen toprağa verilir.

05.01. Suşların Seçimi
Hangi baklagil için inokülant üretilecekse o baklagil köklerinden nodüller toplanır. Farklı bölgelerden çok sayıda bitkiden elde edilen izolatlarda çeşitli testler yapılarak en iyi özellik gösterenler seçilir.

Bu seçimde, suşların azot fiksasyon yeteneği, baklagil bitkisi ile simbiyotik yaşama uyum, toprakta doğal olarak bulunan yabani Rhizobium suşları ile rekabet edebilme gibi özellikler sırasıyla laboratuvar, sera ve tarla denemeleri ile belirlenir.

05.02. İnokülant Üretimi
Sıvı Besiyerinde Üretim: İnokülant üretiminde ilk aşama seçilmiş suşların sıvı besiyerinde üretilmesidir. Bu amaçla önce erlenlerde üretilen bakteriler sonra büyük kapasiteli fermentörlere alınır ve buradan aktif halde Rhizobium kültürü elde edilir. Sıvı besiyerindeki üretimlerde asitliğin nötr düzeyde tutulması gerekir.

Pit Hazırlanması: Pit, yüksek miktarda (en az %60) organik madde içeren topraktır. İşletmeye gelen pit önce kurutularak nemi %40’tan %10'a düşürülür. Bu amaçla toprak çekiçli değirmende öğütülürken 180-200 °C‘da sıcak hava verilir. Sıcak havanın bir başka görevi topraktaki mikrobiyel yükü azaltmaktır. Ancak bu şekilde mutlak bir sterilizasyon sağlanamaz. Değirmenin üzerinde bulunan bir hava emiş makinesi ile öğütülen toprağın 200 mesh'lik partikülleri (~70 μ) değirmenden dışarı çekilir. Daha büyük partiküller ise yer çekimi ile yine değirmen kısmına düşerler. Dışarı verilen kısım 200 mesh elekten geçirilir. Bu şekilde %10 nemli pit hazırlanır. Bunun asitliğinin düşürülmesi için gereken miktarda kireç ilave edilir ve bu karışım bir banttan geçerken üzerine sıvı Rhizobium kültürü püskürtülür. Hidrofob özellik gösteren pit ancak üzerine ince zerrecikler halinde püskürtülen sıvı kültür ile karışabilir. Bu arada ekzotermik reaksiyon meydana gelebilir. Açığa çıkan sıcaklık Rhizobium bakterilerine zarar verir. Bu nedenle püskürtme işleminin çok yavaş ve kontrollü olarak yapılması gerekir. Karıştırma sonunda nem %40 olmalıdır.

Olgunlaştırma: Pit ile karıştırılmış Rhizobium kültürüne ham inokülant adı verilir. Çelik kaplara doldurulan ham inokülant 28 °C'da ve %90 bağıl nemde 1 hafta süre ile olgunlaştırılır. Bu süre içinde ham inokülantta bulunan Rhizobium bakterilerinin sayısı artar. İnkübasyon sırasında ham inokülant sürekli karıştırılarak, kaplarda altta kalan kısımlarda anaerobik reaksiyonun cereyan etmemesi sağlanır. Daha sonra torbalara doldurulan inokülant 0-15 °C 'da depolanır.

Steril Pit ile Yapılan İnokülant Üretimi: Kurutma sırasında sıcak hava uygulaması ile pit içinde bulunan mikroorganizma sayısı önemli ölçüde düşürülse bile mutlak sterilizasyon sağlanamaz. Bazı üretim tesisleri piti tam olarak sterilize ederek kültür ile karıştırırlar. Burada 2 sterilizasyon yöntemi vardır. Birinci yöntemde naylon torbalara doldurulan pit otoklavda sterilize edilir, sonra torba içinde iken bakteri kültürü ilave edilir. Burada kullanılan torbalar otoklav sıcaklığına dayanıklı ve oksijen geçirme özelliğinde olmalıdır. Bu yöntemde otoklavlama sırasında pitteki organik maddelerin yapılarının bozularak Rhizobium için toksik etki gösterecek maddelere dönüşmesi söz konusudur. Diğer yöntem gamma radyasyonudur. Bir banttan geçirilen torbalanmış pite 5 MRad gamma radyasyonu uygulanır. Bu dozdaki radyasyon uygulaması ile pit tam olarak sterilize edilir, sonra torbalara bakteri ilave edilir, torbalar kapatılır ve olgunlaşmaya bırakılır.

05.03. Biyolojik Gübrenin Uygulanması
Biyolojik gübre ya doğrudan doğruya tarlaya verilir ya da baklagil tohumu ile kaplanarak toprağa verilir. İlk yöntem fazla kullanılan bir uygulama şekli değildir. Yaygın olarak uygulanan sistem baklagil tohumlarının inokülant ile kaplanarak ekilmesi yöntemidir. Bu yöntemin üstünlüğü tohum çimlendikten sonra kök bölgesine çok yakın olan rizosfer bölgesinde seçilmiş suşlarla oluşan Rhizobium bakterilerinin bulundurulmasıdır. Paketlenmiş olarak çiftliğe getirilen inokülant ile baklagil tohumlarının karıştırılması çiftçi tarafından yapılır. Bu amaçla %10 şekerli su çözeltisi hazırlanır, inokülant bununla bulamaç haline getirilir, sonra tohumlarla karıştırılır.

Tohum başına düşecek canlı Rhizobium sayısının 10⁵ adet olması önerilir. Buna göre büyük tohumlar (fasulye, nohut, soya) için %1; orta büyüklükteki tohumlar (mercimek, fiğ, korunga) için %1,5; küçük tohumlar (yonca) için %3 oranında inokülant hesap edilmelidir (100 gram tohum için 1-1,5-3 g inokülant). Kullanılacak şekerli su miktarı ise tohum iriliğine göre seçilecek gübre miktarı, çevre sıcaklığı ve çevre nemine göre 100 kg tohum için 1-2 litre arasında değişir. Örneğin 100 kg tohum için 1 kg biyolojik gübre kullanılıyorsa, çevrenin bağıl nemi yüksek, sıcaklığı düşükse tohum yüzeyine aktarılacak su daha geç kuruyacağı için 1 litre şekerli su yeterlidir. Aksi takdirde bu miktar 2 litreye kadar çıkarılır.

Özellikle çok sıcak bölgelerde ekim işleminin sabah erken saatlerde yapılması gerekir. Bu durumda tohum ile inokülantın karıştırılması işlemi geceden yapılır, karışım gece boyunca kurumaya bırakılır, tohumlar sabah erken saatte ekilir.

Şekerli su bir yandan tohumlar üzerine inokülantın yapışmasını sağlarken diğer yandan şeker moleküllerine bağlı bir film tabakası oluşacağından, toprakta su bulunmazsa dahi bakterilerin bir süre daha canlı kalmasını sağlar.