Faj Analizleri
Bakteri, maya ve küf analizlerinde izolasyon ile sayım vb. analizlerde laboratuvarda hazırlanan besiyerleri kullanılır. Oysa faj analizlerinde asıl besiyeri fajın etkili olduğu konakçı hücresidir. Bir diğer deyişle bir ortamdan faj izole etmek için hedef faj için ilgili konakçı hücresi bulunmalıdır. Konakçı en azından tür düzeyinde olmalıdır ancak çoğu kez serotipler önemlidir. Dolayısı ile bir ortamdan sadece belirli bir konakçıya özgü fajlar izole edilebilir. Örneğin bir tavuk dışkısında L. monocytogenes fajları aranır ve sonuç “yok” olarak alınırsa sadece bu bakteriye özgü faj olmadığı anlaşılır ama aynı numunede başka bakterilere özgü fajlar olabilir.
Bir numuneden önce belirli bir bakteri (örneğin Salmonella) izole edilip, aynı numunede bu konakçıya özgü fajlar aranabilir. Ancak analiz edilen numunede Salmonella bulunamaz ise bu sonuç, aynı numunede bu bakteriye özgü fajların olmadığı anlamına gelmez. Devamında numuneden Salmonella Enteritidis izole edildiğini varsayalım. Analize bu izolat ile devam edilirse ve faj izole edilemezse bu sonuç sadece numunede Salmonella Enteritidis fajı olmadığını gösterir ancak, başka serotiplere özgü fajlar bulunabilir. Bu durumda faj analizlerinde kültür koleksiyonlarında bulunan serotipler hatta aynı serotipin farklı suşları ile devam edilmesi faj izolasyonunda pozitif sonuç alınma şansını yükseltir.
Faj izolasyonunda farklı protokoller vardır ancak en yaygın protokollerden biri; numunenin steril bir tampon çözeltide (örneğin SM tampon çözeltisi) 1/10 w/v homojenizasyonu, homojenizatın kaba partiküllerden uzaklaştırılması amacıyla 4 oC’ta 2500x g’de santrifüjlenmesi ve süpernatantın önce 0,45 µm sonra 0,2 µm porlu filtreden geçirilmesi, filtrenin steril tampon çözeltisi ile yıkanması ilk aşamanın son uygulaması olarak filtratın hedef konakçı için uygun bir genel sıvı besiyerine (örneğin CASO broth) aktarılması ve konakçı bakteri kültürünün ilavesi ile çalkalamalı inkübatörde konakçı bakteri için optimum sıcaklıkta 24 saat inkübasyona bırakılarak muhtemel faj ile konakçı bakterinin temasının sağlanmasıdır.
Sonraki aşamada kültür yeniden 4 oC’ta 2500x g’de 10 dakika boyunca santrifüjlenir ve lize olan bakterilerin çöktürülmesi sağlanır ve süpernatant 0.22 µm porlu filtrelerden geçirilip 45-50 oC sıcaklıktaki 3 mL LB yumuşak agar (%0.6 agar) içerisine 100 µL zenginleştirilmiş saf faj süspansiyonu ve 100 µL konakçı aktarılarak tüp karıştırıcıda karıştırılır (vortekslenir), LB agar (%1.2 agar) besiyerleri içeren Petri kutularının üzerine homojen şekilde aktarılır. 37 oC’ta 24 saat inkübasyon sonunda plak oluşumuna göre faj varlığı tespit edilir. Plak, besiyerinde konakçı bakterinin faj saldırısı sonunda lize olarak berrak zonlar oluşturmasıdır.
Sonraki çalışmalarda kullanılmak amacıyla faj titresinin artırılması gerekir. Bu amaçla yukarıda açıklanan şekilde elde edilen faj plakları steril bir spatül ile kesilerek faj zenginleştirme işlemine devam edilir.