Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji1

01. Giriş  
02. Besi Yerindeki Oksijenin Giderilmesi ve Redüksiyon Şiddetinin  Artırılması 
02.01. Isı ile Oksijenin Çıkarılması 
02.02. Besi Yerlerine Redüktan Maddelerin  Katılması  
03. Havadaki  Oksijenin   Giderilmesi  
04. Her iki Yöntemin Birlikte Kullanılması  
05. Redüktan Maddeler    

01.Giriş

İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan bazı mikroorganizmalar, içinde oksijen bulunmayan (anaerobik) besi yerlerinde üreyebilir. Böyle mikroplarda (klostridium, aktinomices, sferoforus, v.s.) oksijen toksik etki yaratır. Bunlar aynı zamanda oksijen ile ilişkili herhangi mekanizmaya da (sitokrom oksidase, katalase, peroksidase, vs.) sahip değildirler. Anaerobların üremesi düşük oksidasyon-redüksiyon potansiyeline bağlıdır ve bu da hava bulunan ortamlarda imkansızdır. Serbest oksijenin bulunduğu durumlarda oluşan biyooksidasyon reaksiyonlarında, genellikle, hidrojen peroksit teşekkül eder. Mikroplar, bunu kendilerinde bulunan özel katalase enzimleri ile ayrıştırırlar. Halbuki, anaeroblarda bu enzim olmadığından, H2O2 ayrıştırılamaz ve toksik etki yapar.

Patojenik anaerobik mikropları üretmek için birçok metotlar ortaya konulmuştur. Bunlar genel olarak üç prensip üzerinde birleşmektedirler. 1. Besi yeri içindeki oksijenin giderilmesi ve redüksiyon şiddetinin artırılması, 2. Besi yerinin bulunduğu ortamın havasındaki oksijenin çıkarılması ve 3. Her iki yöntemin birlikte kullanılması.  

02. Besi Yerindeki Oksijenin Giderilmesi ve Redüksiyon Şiddetinin  Artırılması

02.01. Isı ile Oksijenin Çıkarılması

a) Sıvı besi yerleri: 10-15 dakika kaynatılarak içinde erimiş bulunan oksijen dışarı çıkarılabilir. Kaynatılmış olan besi yeri hemen soğuk suya veya buzlu suya daldırılarak, tüp içindeki havada bulunan oksijenin absorbe olması minimal düzeye indirilir. Hemen inokulasyon yapılır ve besi yerinin üstüne steril petrol jeli, erimiş agar veya sıvı parafinden birisi ilave edilerek örtülür (yaklaşık 0,5 cm kalınlıkta) ve optimal ısıda inkubasyona konur.

b) Agar besi yeri de ayni şekilde ısıtıldıktan sonra 45°C ye kadar ılıtılır ve anaerobik olarak üretilmesi istenen mikroorganizma veya şüpheli madde ekilir. Tüp yavaşça döndürülerek karıştırılır (agar içinde hava girmemeli ve pipetle ekerken solunum havası agara kaçmamalıdır) ve hemen etüve yerleştirilir.

Bu iki besi yerinde bu usulle tam bir anaerobiozis temin edilemez. Mikroorganizmalar üredikten sonra sıvı ortamlarda meydana gelen gaz (CO2) üstte bulunan sıvı parafinin içine birikir. Eğer parafin yerine agar konmuşsa, bu sefer gaz agarı yukarı doğru iter.

c) Yarı katı agar: Bu besi yeri de iyice kaynatıldıktan ve 45°C’ye kadar ılıklaştırıldıktan sonra dip tarafına ekim yapılır ve optimal ısıda üretilmeye terk edilir. Fakat, bu besi yerinin üst tarafında tam bir anaerobiozis oluşmaz.

d) Roux metodu: Isıtılmış ve 45°C ’ye kadar ılıklaştırılmış agar veya jelatin besi yerlerine ekim yapıldıktan sonra küçük dar tüplere çekilir ve bunların iki ucu alevde kapatılır. İnkubasyondan sonra üreme meydana gelirse, tüpler steril şartlar altında kırılarak içindeki besi yeri dışarı alınır ve içinde bulunan kolonilerden istenenler seçilerek ayrı bir besi yerine ekilir.  

02.02. Besi Yerlerine Redüktan Maddelerin  Katılması

a) Sıvı besi yerlerine, küçük parçalar halinde beyin, böbrek, karaciğer, et, vs. steril  taze dokuların katılması, ortamın redüksiyon şiddetini arttırır.

Pratike beyinli ve kıymalı besi yerleri çok kullanılmaktadır. Üreme tüpün dibinde meydana gelir. Bu sebepten ekimler dibe yapılmalıdır. Besi yerinin üzerine herhangi bir kapatıcı madde koymaya lüzum yoktur. Bu besi yerlerinin miktarı 10 cc. den aşağı olmamalıdır.

b) Sıvı besi yerlerine redüksiyon özelliğine sahip kimyasal maddelerin (glukoz, sistein, sodyum formaldehid sulfoksilat, sodyum tioglikolat, vs.) ilavesi ile anaerobik ortamlar elde edilebilir.

c) İçinde % 1 glukoz bulunan agar besi yeri eritildikten sonra 45°C ‘ye kadar ılıklaştırılır ve yukarda bildirildiği şekilde ekim yapılır. Tam anaeroblar agarın dibinde, fakültatifler ise besi yerinin her tarafında bir üreme gösterirler.

d) İndirgen madde katılmış katı veya yarı katı besi yerleri için Brewer'in özel petri kutusu kullanılır. Buna, içinde sodyum tioglikolat ve metil mavisi bulunan agar döküldükten sonra, agarın yüzeyine ekim yapılır. Besi yeri ile kapak arasında kalan dar boşluktaki havanın oksijeni, tioglikolat yardımı ile indirgenerek anaerobik bir duruma getirilir.Petri kutusunun kenarları erimiş agar veya parafinle iyice kapatılır.  

03. Havadaki  Oksijenin   Giderilmesi

1. Büchner metodu: Bu metot, havadaki oksijenin alkali yardımı ile adsorbsiyonu üzerine istinad eder. Geniş bir tüpün dibine pirogallol konduktan sonra üzerine % 30 oranında NaOH ilave edilir. Tüpün içine, inokule edilmiş tüpler yerleştirilir ağzı iyice kapatılır ve inkubasyona terk edilir.

2.  Spray metodu: Özel bir şekilde hazırlanan aletin dibinde bulunan bölmelerden birine pirogallol diğerine ise NaOH konur. Aletin kapağına, besi yeri konup ekildiğinden sonra, iyice kapatılır ve kenarları da parafinlenir. Alet eğilerek NaOH'in pirogallol ile teması temin edilir ve etüve yerleştirilir.

3. Lochkart tüp metodu: Test tüpünün içindeki besi yerine ekim yapıldıktan sonra, ortasında küçük presipitasyon tüpü olan pamuk içeri doğru itilir (küçük tüpün içinde 2cc. % 40'lık NaOH ve 2 cc. de % 20'lik pirogallol vardır). Test tüpün ağzı iyice kapatılır ve optimal ısıda inkubasyona bırakılır.

4. Wilson anaerobik petri kutusu: Bu metot spray metoduna benzer. Bu usulde iki petri kutusu kapağı karşılıklı yerleştirilmiştir. Kapakların birinde besi yeri diğerinde ise pirogallol ve NaOH karışımı vardır. Yalnız, iki kapak arasında ortasında 4 cm. çapında delik olan bir metal tabaka bulunmaktadır. Bu levha, alkali karışımın tesadüfen besi yerine değmesini önler. Ekim yapıldıktan sonra iki kapağın arası parafinle veya flaster ile iyice kapatılır ve etüve yerleştirilir.

5. Mc Instosh - Fieldes anaerobik kavanozu: Bu teknikte, özel olarak imal edilmiş alette bulunan platin veya palladinize aspestos elektrikle ısıtılır ve bu esnada kip cihazından elde edilen hidrojen gazı içeri sevk edilir. Hidrojen ısıtılmış katalizatörler yardımıyla, içerideki havanın oksijeni ile birleşerek su meydana getirir ve bu su, aletin dibinde bulunan CaCL2 veya diğer bir su çekici (hidroskopik) madde tarafından emilir. Bu alet yardımıyla iyi bir anaerobik ortam elde edilebilir.

6. Gaspackli kavanoz: Çok fazla kullanılmaya başlanan bu teknikte, saydam plastikten yapılmış özel kavanozun içine, sıvı ve katı besi yerleri konduktan sonra, havadaki oksijeni sarf eden özel gaspack paketi yerleştirilir. Ayrıca, kavanozun içine % 95 N2 + % 5 H2 karışımı konarak tam bir anaerobiozis sağlanır.

7. Novyi metodu: Bu usulde, musluklu bir kavanozun havası, vakumla çekilerek anaerobik şartlar  temin edilir. Kavanozun içine, ekilmiş tüp veya petri kutusu yerleştirilir. Ayrıca, aletin dibine, bir miktar NaOH ve pirogallik asitte konabilir.

8. Aerobik mikroorganizmalar ile: Petri kutularından birindeki katı besi yerine aerobik (Örn., Serratia marcescens), diğer petri kutusundakine de üretilmesi istenen anaerobik mikrop ekilir ve ekilen petri kutuları karşılıklı getirilir ve parafin veya flasterle iyice kapatıldıktan sonra optimal ısıda inkube edilir. Bu usulde, aerobik mikrop üreyerek havadaki oksijeni sarf eder ve bundan sonra da anaerob mikroorganizma üremeye başlar.

Günümüzde laboratuar da en fazla gaspackli kavanozlar tercih edilmektedir. Diğerlerinden bir kısmının tarihi değeri vardır. Tam güvenilir olmaması nedeniyle kullanılmamaktadırlar.  

04. Her iki Yöntemin Birlikte Kullanılması

Bu tarz uygulamada, besi yeri içindeki oksijen vasat ısıtılarak veya diğer tarzlarda giderildikten sonra, kültürlerin konulduğu kavanozun içindeki hava ve oksijen de çeşitli yöntemlerle çıkarılır. Böylece iyi bir anaerobik ortam sağlanmış olur.

Diğer metotlar

a) Krom ve sülfürik asitli kavanoz: Bu usulde anaerobiozis iki reaksiyondan sonra teşekkül eder:

Cr + H2SO4 ¸ Cr CO4 + H2                                          1.reaksiyon  
CrSO4+H2SO4+O2®2 Cr(SO4)2+ 2H2O2                  2.reaksiyon

Bu reaksiyonların sonunda kavanozun içindeki oksijen sarf edilerek anaerobik bir ortam teşekkül eder.

b) Fosforlu kavanoz: Çabuk ve iyi bir metot olmasına karşın tehlikelidir. Kavanoz içine konan sarı fosfor, havadaki oksijen bitinceye kadar yanar ve oksijeni sarf eder. Kavanozun dibinde bulunan az miktardaki su, teşekkül eden fosfor pentaoksidi emer.

c) Mumlu kavanoz: Kavanozun içine konan mum havadaki oksijen bitinceye kadar yanar ve bitince söner. Emin bir metot değildir.

d) Demir yünü ile anaerobiozis: Demir yünü 10 gr. ve içinde ıslatıcı maddelerden Tween 80 veya Lissapol bulunan % 0.25 - 0.5 bakır sülfat üzerine pH'sı 1,5 - 2.0 oluncaya kadar H2SO4 ilave edilir ve bir petri kutusuna yerleştirilir. Demir yününün üzeri metal bakırla kaplanır ve bu da kavanozun havasındaki oksijeni alarak okside olur ve böylece oksijen sarf edilir.

Anaerobiyosizin tam teşekkül ettiğini anlamak için bazı metotlar vardır. Bunlar içinde en çok kullanılan metilen mavili indikatördür.

Hazırlanması

Sol - A: 6 cc. N/10 NaOH distile                                      su ile 100 cc. ye tamamlanır.  
Sol- B:  3 cc. % 0.5 metilen mavisi,                                  su ile 100 cc. ye tamamlanır.  
Sol - C: 6 g. glukoz 100 cc.                                              suda eritilir.

Bunlardan eşit miktarda bir test tüpüne konur ve rengi gidinceye kadar ısıtılır ve hemen kavanoza yerleştirilir. Bundan sonra kavanozun havası vakumla çekilir. Solusyonun renksiz kalışı anaerobiozisin iyi teşekkül ettiğini gösterir. İnkubasyon süresi içinde solusyonun renksiz kalması gerekir. Mavi renk oluşumu anaerobiozis'in bozulduğunu ifade eder.

Solüsyon taze olarak hazırlanır ve kullanılır.  

05. Redüktan Maddeler

Tioglikollik asit: Tioglikollik asit veya bunun sodyum tuzu (sodyum tioglikolat) besi yerlerine % 0.01 - 0.2 oranında katılır. Bu maddenin zamanla mikroplar üzerine toksik etkisi olabilir. Bunun için taze hazırlanmalı ve hemen kullanılmalıdır.

Glikoz: Glikoz besi yerlerine % 1 oranında katılır. Toksik etkisi yoktur. İyi bir redüktan olduğu gibi üremeyi de kamçılar. Katı besi yerlerinde bulunan glikozun ayrışması sonu gaz meydana geldiğinden, az tercih edilir. Teşekkül eden gaz agarı parçalar.Ayrıca, glikozun ayrışması sonu oluşan organik asitler ortamın pH'sını düşürür ve üreme üzerine olumsuz yönde etkiler.

Askorbik asit: Katı besi yerlerine % 1 oranında katılır. Bu madde spor vermeyen mikroplar için hafif bir inhibitör etkiye sahip olabilir.

Sistein: Besi yerlerine % 0.05 miktarında ilave edilir. Fazlası inhibitördür.

Metal demir: Sıvı besi yerlerine tel, iğne, v.s. şekilde demirli maddeler konarak redüksiyon şiddeti artırılır.

Taze steril dokular: Sıvı besi yerlerine taze kobay böbreği veya karaciğeri ilave edilerek anaerobik şartlar elde edilebilir. Ölü doku parçaları da ayni tarzda etkiler.

Kıymalı veya beyinli besi yerleri: Bunlar,  pratikte çok kullanılan ucuz ve basit besi yerleridir.

Taze veya ölü dukalar içinde çok fazla miktarda redüktan maddeler bulunmaktadır. Böyle maddelerin başında glutation vardır. Glutation, birbirine peptid bağlı ile bağlanmış glutamik asit ve sisteinden meydana gelmiştir. Bunlarda bulunan sülfidril gruplarının (SH), ortamın oksidasyon - redüksiyonunda önemi fazladır.

Redükte olan 2 mol. glutation, kendi sulfidril gruplarındaki hidrojeni verir ve disulfide okside olur. Bu da iki atom hidrojen ilavesi ile kolayca redükte olabilir.

2. Glutation - SH + B <=  =>  Glutation - SSG + BH2  
redükte olan                                      okside olan  
glutation                                             glutation       

[1] Kaynak: Temel Mikrobiyoloji