Vitamin Nicotinic Acid Assay Broth (Merck 1.11992)

AOAC ve USP yönergelerine uygundur. İlaç, gıda, yem ve diğer pek çok sektörde In vitro (canlı hücre dışında) olarak, mikroorganizmalar kullanılarak vitamin miktarı tayininde kullanılılan sıvı besiyeridir.

Bazı bakteri türleri ve mayalar belirli vitaminlere karşı tam bağımlılık özelliği gösterirler. Bu mikroorganizmalar, (ihtiyaç duydukları vitamin hariç) gelişmeleri için gerekli olan bileşenlerin tamamını içeren bir besiyerine ilave edildiklerinde gelişmelerini tamamen durdururlar ya da hızla azaltırlar. İhtiyaç duydukları vitaminin ilave edilmesi ile mikroorganizmalar gelişmeye başlar ve bu gelişim, ilave edilen vitaminin konsantrasyonuna bağlı olarak değişir. Bu yönteme dayanarak bazı vitaminlerin konsantrasyonları, mikroorganizmalar kullanılarak, mikrobiyel gelişme sonucu oluşan bulanıklığın (türbidimetrik olarak) veya metabolitlerin (ör. laktik asit) (titrimetrik olarak) ölçülmesi ile kantitatif olarak belirlenebilir. Özelliği ve miktardaki bilinen saf vitaminin artan konsantrasyonları ile gerçekleştirilmiş paralel çalışmalar, bu vitamin için analiz standardını oluşturur.

Bileşimi

D(+) Glucose anhydrous 40 g/L; Casein hydrolysate "Vitamin-free" 12 g/L; DL-Alanine; L-Asparagine; L-Cysteinium chloride; L-Cysteine 400 mg/L; L-Tryptophane 100 mg/L; Adenine 20 mg/L; Guanosin 40 mg/L; Uracil 20 mg/L; Xanthine 10 mg/L; 4-Amino-benzoic acid 200 µg/L; L(+)Ascorbic acid; D(+)Biotin (Vitamin H) 0,8 µg/L; Calcium D(+)pantothenate 200 µg/L; Folic acid; Nicotin acid; Pyridoxol hydrochloride 400 µg/L; Pyridoxamine hydrochloride; Riboflavin 400 µg/L; Thiaminium dichloride 200 µg/L; di-potassium hydrogen phosphate 1 g/L; Iron(II) sulfate 20 mg/L; Potassium dihydrogen phosphate 1 g/L; Magnesium sulfate 400 mg/L; Manganese(II) sulfate 20 mg/L; tri-sodium citrate dihydrate; Sodium acetate anhydrous 20 g/L; Sodium chloride 20 mg/L şeklindedir.

Hazırlanması

Dehidre besiyeri kısa süreli kaynatma ile 75 g/L olacak şekilde bidistile su içinde eritilir. Mikro-Inoculum Broth bileşimi, Proteose peptone 5,0 g/L; Yeast extract 20,0 g/L; D(+)glucose 10,0 g/L; Potassium dihydrogen phosphate 2,0 g/L; Tween 80 0,1 ml/L şeklindedir. 10 g Agar, Micro-Inoculum Broth'a ilave edilir ve otoklavda 121 ^oC'da 15 dakika sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası 25 ^oC'da pH'sı 6,7±0,1'dir.

Analiz Yöntemi

-Dehidre besiyeri 7,5 g / 100 mL olacak şekilde bidistile su içinde eritilir.

-Sık sık çalkalayarak 2-3 dakika gibi kısa süreli kaynatma uygulanır.

-Analiz edilecek örnek, dilüsyon serisi şeklinde tüplere konur ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır.

-Hazırlanmış bu tüplere 5'er mL besiyeri dağıtılır ve sterilize edilir.

-Soğutulmuş tüplere 1'er damla inokülasyon kültürü ilave edilir.

-37 ^oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır.

-Oluşan bulanıklık 546 nm dalga boyunda fotometrik olarak ölçülür.

Nicotinic Acid Testi

Örnek hazırlama: Serbest nikotinik asit ve nikotinamid miktarı önceden bilinen örnekte miktar belirlenmesi için (ör. ilaç sektörü gibi), bidistile su ile ekstaksiyon yapılır ve analiz sonunda elde edilmesi beklenen bulanıklık miktarı, kalibrasyon eğrisinin orta değerine ulaşana kadar örnek seyreltilir. Eğer vitamin miktarı bilinmeyen örnek analiz edilecekse öncelikle konsantre edilmiş ekstrakt ile genel bir miktar belirlemesi yapılmalıdır. Vitamin bağ oluşturmuş durumdaysa (ör. doğal sebze ürünleri) asit hidrolizi ile serbest hale getirilmelidir.

Asit hidrolizi: 1 g örnek 50 mL 0,5 N HCl içerisinde eritilir ve 121 ^oC'da 1 saat otoklavlanır. Soğutulduktan sonra 2,5 N soydun asetat ile pH 4,5'e ayarlanır ve filtre edilir. Filtrat pH’sı 6,8’e ayarlanır ve analiz için gerekli optimum konsantrasyona kadar seyreltilir.

İnokülasyon: Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) suşu Micro-Inoculum Broth veya eşit oranda karıştırılmış kültür besiyeri ve standart çözelti (1mcg/mL) karışımına ekilerek 37 ^oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır. Daha sonra kültür santrifüj edilir, fizyolojik tuzlu su ile birkaç defa yıkanır ve mikrobiyel sayı 3 x 108 bakteri/mL olacak şekilde ayarlanır.

Kalibrasyon: 100 mg nikotinik asit ve nikotinamid 1 L bidistile suda (içerik: 1 mcg/mL) eritilir ve 200 ng/mL'ye seyreltilerek referans çözelti hazırlanır. Bu çözeltiden 0-50-100-200-300-400-1000 ng nikotinik asit ve nikotinamid /10 mL dilüsyon (seyreltme) serisi oluşturacak şekilde tüplere 0.0-0.25-0.5-1.0-1.5-2.0-2.5-5.0 mL çözelti pipetlenir ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır. Kontrol tüplerine (kültür ve sterilite kontrolü için) sadece 5,0 mL damıtık su konulur.

Örnek: Analiz edilecek örnek çözelti, kalibrasyon aşamasındaki gibi dilüsyon (seyreltme) seriler şeklinde tüplere dağıtılır ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır.

Besiyeri hazırlama, inokülasyon: Dehidre Vitamin Nicotinic Acid Assay Broth besiyeri kısa süreli kaynatma ile 75 g/L olacak şekilde bidistile suda eritilir. pH kontrol edilir ve gerekirse ayarlanır (25 ^oC'da pH'sı 6,8). Örnek ve referans çözelti dilüsyonlarını içeren tüm tüplere 5 mL kültür besiyeri kontrollü bir şekilde ilave edilir ve tüpler kapakları kapatılarak otoklavda 115 ^oC'da 10 dakika sterilize edilir. Soğutulmuş tüplere 1'er damla aşılama kültürü ilave edilir (sterilite kontrol tüpleri hariç). 37 ^oC'da 16-18 saat inkübasyona bırakılır.

Değerlendirme: Tüm tüpler fotometrik olarak 546 nm dalga boyunda incelenir ve optik bulanıklıkları (OD) ölçülür. Referans çözelti ile hazırlanmış tüplerden ölçülen bulanıklık değerleri standart madde miktarına karşılık gelecek şekilde bir grafiğe aktarılır ve kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Analiz edilen örnekteki nikotinik asit ve nikotinamid miktarı bu eğriye göre hesaplanır. Suya karşı kontrol kültürle yapılan okumalarda OD (546 nm, 1 c) < 0,150 olması durumunda analiz sonuçları anlamlı olmaktadır. Sterilite kontrol tüplerinde herhangi bir üreme (bulanıklık) olmamalıdır.

Kalite Kontrol

Ürün Bilgileri