Vitamin Folic Assay Broth, Base (Merck 1.11990)

AOAC ve USP yönergelerine uygundur. İlaç, gıda, yem ve diğer pek çok sektörde In vitro (canlı hücre dışında) olarak, mikroorganizmalar kullanılarak vitamin miktarı tayininde kullanılan sıvı besiyeridir.

Bazı bakteri türleri ve mayalar belirli vitaminlere karşı tam bağımlılık özelliği gösterirler. Bu mikroorganizmalar, (ihtiyaç duydukları vitamin hariç) gelişmeleri için gerekli olan bileşenlerin tamamını içeren bir besiyerine ilave edildiklerinde gelişmelerini tamamen durdururlar ya da hızla azaltırlar. İhtiyaç duydukları vitaminin ilave edilmesi ile mikroorganizmalar gelişmeye başlar ve bu gelişim, ilave edilen vitaminin konsantrasyonuna bağlı olarak değişir. Bu yönteme dayanarak bazı vitaminlerin konsantrasyonları, mikroorganizmalar kullanılarak, mikrobiyel gelişme sonucu oluşan bulanıklığın (türbidimetrik olarak) veya metabolitlerin (ör. laktik asit) (titrimetrik olarak) ölçülmesi ile kantitatif olarak belirlenebilir. Özelliği ve miktardaki bilinen saf vitaminin artan konsantrasyonları ile gerçekleştirilmiş paralel çalışmalar, bu vitamin için analiz standardını oluşturur.

Bileşimi

D(+) Glucose anhydrous 40 g/L; Casein hydrolysate "Vitamin-free" 12 g/L; DL-Alanine 400 mg/L; L-Asparagine 200 mg/L; L-Cysteinium chloride; L-Cysteine 200 mg/L; L-Tryptophane 100 mg/L; Adenine 20 mg/L; Guanosin 40 mg/L; Uracil 20 mg/L; Xanthine 10 mg/L; 4-Amino-benzoic acid 200 µg/L; L(+) Ascorbic acid; D(+) Biotin (Vitamin H); Calcium D(+) pantothenate 400 µg/L; Folic acid; Nicotin acid 2 mg/L; Pyridoxol hydrochloride 4 mg/L; Pyridoxamine hydrochloride; Riboflavin 2 mg/L; Thiaminium dichloride 2 mg/L; di-Potassium hydrogen phosphate 1 g/L; Iron(II) sulfate 20 mg/L; Potassium dihydrogen phosphate 1 g/L; Magnesium sulfate 400 mg/L; Manganese(II) sulfate 20 mg/L; tri-Sodium citrate dihydrate 30 g/L; Sodium acetate anhydrous 20 g/L; Sodium chloride 20 mg/L; şeklindedir.

Hazırlanması

Dehidre besiyerinden 106 g kısa süreli kaynatma ile 0,4 ml Tween 80 ve 1 L bidistile su içinde eritilir. Mikro-Inoculum Broth bileşimi, Proteose peptone 5,0 g/L; Yeast extract 20,0 g/L; D(+)glucose 10,0 g/L; Potassium dihydrogen phosphate 2,0 g/L; Tween 80 0,1 ml/L şeklindedir. 10 g Agar, Micro-Inoculum Broth'a ilave edilir ve otoklavda 121 ^oC'da 15 dakika sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası 25 ^oC'da pH'sı 6,7±0,1'dir.

Analiz Yöntemi

-Dehidre besiyerinden 106 g, 0,4 ml Tween 80 ve 1 L bidistile su içinde eritilir.

-Sık sık çalkalayarak 2-3 dakika gibi kısa süreli kaynatma uygulanır.

-Analiz edilecek örnek, dilüsyon serisi şeklinde tüplere konur ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır.

-Hazırlanmış bu tüplere 5'er mL besiyeri dağıtılır ve sterilize edilir.

-Soğutulmuş tüplere 1'er damla inokülasyon kültürü ilave edilir.

-37 ^oC'da 16-20 saat inkübasyona bırakılır.

-Oluşan bulanıklık 546 nm dalga boyunda fotometrik olarak ölçülür.

Folic Acid Testi

Örnek hazırlama (Ekstraksiyon): İncelenecek örnekten folik asit ekstraksiyonu, eşit miktarda su ve NaSO4 ilavesi ve ısı uygulaması ile yapılmaktadır. Bağ oluşturmuş folik asidi serbest hale getirebilmek için enzimatik ön işlem uygulanmalıdır. Bunun için 1 g örnek 150 mL 0,05 N fosfat tamponda (pH 7,2) homojenize edilir ve 121 ^oC'da 15 dakika otoklavlanır. 20 mg pancreatin (dried) ilavesinden sonra 37 ^oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır. Daha sonra 121 ^oC'da 5 dakika otoklavlanır ve soğutularak filtre edilir.

İnokülasyon: Enterococcus hirae (ATCC 8043) suşu Micro-Inoculum Broth'a ekilerek 37 ^oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır. Daha sonra kültür santrifüj edilir, fizyolojik tuzlu su ile birkaç defa yıkanır ve mikrobiyel sayı 2 x 108 bakteri/mL olacak şekilde ayarlanır.

Kalibrasyon: 50 mg folik asit 30 mL 0,01 N NaSO4’de eritilir. 300 mL bidistile su ilave edilir ve 500 mL’ye tamamlanarak pH 7,8±0,5’e ayarlanır (içerik: 100 mcg/mL). Daha sonra bu stok çözelti 2 ng/mL'ye seyreltilerek referans çözelti hazırlanır. Bu referans çözeltiden 0,0-0,5-1,0-2,0-4,0-8,0-10,0 ng folik asit/10 mL dilüsyon (seyreltme) serisi oluşturacak şekilde tüplere 0,0-0,25-0,5-1,0-2,0-4,0-5,0 mL çözelti pipetlenir ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır. Kontrol tüplerine (kültür ve sterilite kontrolü için) sadece 5,0 mL damıtık su konulur.

Örnek: Analiz edilecek örnek çözelti, kalibrasyon aşamasındaki gibi dilüsyon (seyreltme) seriler şeklinde tüplere dağıtılır ve bidistile su ile 5 mL'ye tamamlanır.

Besiyeri hazırlama, inokülasyon: Dehidre Vitamin Folic Assay Broth, Base besiyerinden 106 g kısa süreli kaynatma ile 0,4 mL Tween®80 ve 1 L bidistile su içinde eritilir. pH kontrol edilir ve gerekirse ayarlanır (25 ^oC'da pH'sı 6,8). Örnek ve referans çözelti dilüsyonlarını içeren tüm tüplere 5 mL kültür besiyeri kontrollü bir şekilde ilave edilir ve tüpler kapakları kapatılarak otoklavda 115 ^oC'da 10 dakika sterilize edilir. Soğutulmuş tüplere 1'er damla aşılama kültürü ilave edilir (sterilite kontrol tüpleri hariç). 37 ^oC'da 16-20 saat inkübasyona bırakılır.

Değerlendirme: Tüm tüpler fotometrik olarak 546 nm dalga boyunda incelenir ve optik bulanıklıkları (OD) ölçülür. Referans çözelti ile hazırlanmış tüplerden ölçülen bulanıklık değerleri standart madde miktarına karşılık gelecek şekilde bir grafiğe aktarılır ve kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Analiz edilen örnekteki folik asit miktarı bu eğriye göre hesaplanır. Suya karşı kontrol kültürle yapılan okumalarda OD (546 nm, 1 c) < 0,150 olması durumunda analiz sonuçları anlamlı olmaktadır. Sterilite kontrol tüplerinde herhangi bir üreme (bulanıklık) olmamalıdır.

Kalite Kontrol

Ürün Bilgileri